花生营养油对中老年SD大鼠大脑皮层单胺氧化酶活性及肝脏细胞的影响研究

赵康宇，曹 健，田 华，张立伟，郑竟成，罗 质，何东平

（1.武汉轻工大学 食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.大宗粮油精深加工教育部重点实验室（武汉轻工大学），湖北 武汉 430023）

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA，C22∶6n-3），属于ω-3不饱和脂肪酸，花生四烯酸（arachidonic acid，AA，C20：4 n-6），属于 ω-6不饱和脂肪酸，这两种脂肪酸是人脑中主要的长链多不饱和脂肪酸（Long-chain polyunsaturated fatty acids，LCPUFA），是人体大脑和视神经发育的重要物质，对提高智力和增强视敏度具有重要作用[1-3]。DHA是神经系统细胞生长及维持的一种主要脂肪酸，约占人脑总脂的10%，是大脑和视网膜的重要构成成分，促进大脑细胞发育生长，并延缓脑细胞的衰老和凋亡，有利于婴幼儿提高记忆及学习能力，同时也能减少中老年期痴呆症、脑瘫、中风等疾病的发生[4-6]。AA是合成前列腺素 E2、前列腺环素、血栓烷素 A2和白细胞三烯直接前体，这些生物活性物质对人体心血管系统及免疫系统具有十分重要的作用，具有抗炎、抗癌、酯化胆固醇，增加血管弹性、降低血液粘度，调节血细胞功能等一系列生理活性[7-10]。DHA藻油是以裂壶藻（schizochytriumsp.）或者吾肯氏壶藻（ulkeniaamoeboida）或者寇氏隐甲藻（crypthecodiniumcohnii）等藻种为原料经生物发酵、提取、精炼等工艺制取的一种可供食用富含DHA的油脂[11-12]。花生四烯酸油是以高山被孢霉（mortierellaalpina）或者缺刻叶球藻(lobosphaeraincisaReisigl)等藻种为原料经生物发酵、提取、精炼等工艺制取的一种可供食用富含AA的油脂[13-15]。目前DHA藻油和AA油脂主要以微胶囊粉剂添加在婴幼儿奶粉等产品中，如果将直接添加到大众食用植物油中，不仅简化了AA油脂的加工工艺过程，节约生产成本，而且为普通大众及婴幼儿补充DHA及AA提供了一条极为便利的途径[16-17]。

单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）为催化单胺氧化脱氨反应的酶，也称为含黄素胺氧化酶，主要分布于人体内的肝、肾、脑组织中，组织中的 MAO主要存在于线粒体上和膜紧密结合，以脂肪醇氧化酶（fatty-alcohol oxidase，FAO）为辅酶参与儿茶酚胺的分解代谢[18-19]。实验的花生营养油是在前期研究基础上以浓香花生油为基油，添加其他植物油以及AA油脂，按营养成分的科学配比调制而成。以中老年 SD大鼠为实验对象，考察含DHA藻油和AA油脂的花生营养油对 SD大鼠大脑皮层单胺氧化酶活性及肝脏细胞的影响，初步探究花生营养油的生理活性，为含 DHA藻油和 AA油脂的植物营养油开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

18月龄中老年SD大鼠雌雄各半：购于湖北省试验动物研究中心；含DHA藻油和AA油脂花生营养油：由油谷生物科技南京有限公司提供；大鼠单胺氧化酶ELISA试剂盒、苏木素伊红（HE）染色试剂盒：购于上海邦奕生物科技有限公司；其它化学试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

352型酶标仪：芬兰LabsystemsMultiskan MS公司；AC8洗板机：芬兰Thermo Labsystems公司；TG16W微量高速离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；L5S紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；CX40型生物显微镜：宁波舜宇仪器有限公司；Agilent 7890A气相色谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组与饲喂

将18月龄中老年SD大鼠随机分为5组，每组7只。CK1为阴性对照组（饲喂普通花生调和油）、CK2为阳性对照组[DHA藻油和AA油脂混合油（DHA∶AA=1∶0.83）]、以 200、320、640 mg DHA和170、270、530 mgAA分别调配后添加至60 g花生调和油中，作为DHA及AA低、中、高剂量调配油的处理组。从饲喂第一天起，全部 SD大鼠在相同的自然条件下，定时定量进食，自由饮水，保证自然光照，良好通风，以及一定室温，饲养1周以使SD大鼠适应实验环境。待大鼠生长活动正常后，每日上午通过灌胃饲喂，饲喂剂量均为1 mL调配油/100 g体重·d，其余时间自由饮水，持续饲喂8周。

1.3.2 处置方法

SD大鼠饲喂 8周后，采取注射麻醉法，在SD大鼠腹腔注射10%（V/V）水合氯醛对大鼠进行麻醉后迅速将脑组织及肝脏组织剥离，于-20 ℃冻存，用于后续大鼠脑组织及肝脏组织有关成分的检测。

1.3.3 MAO活性测定

采用酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）测定[20]。将MAO标准品稀释到不同浓度,分别为180、120、60、30、15 U/L，稀释后各孔加样量都为50 μL。分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40 μL，然后再加待测样品10 μL（样品最终稀释度为5倍）。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后，于 37 ℃条件下，温育30 min。揭掉封板膜，倒尽板孔中液体，加满洗涤液重复洗涤5次后，用吹风机吹干。每孔加入酶标试剂 50 μL，重复温育、洗涤。加显色剂37 ℃避光显色15 min，再加终止液50 μL，终止反应。以空白空调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。以MAO标准品的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，得到标准曲线，将样品的OD值代入计算出样品浓度。

1.3.4 肝脏细胞形态结构观测

按照苏木素伊红（HE）染色试剂盒内附的说明书进行操作。

1.3.5 花生营养油脂肪酸组成成分分析

色谱柱：Agilent 19091F-433（30 m×250 μm×0.25 μm）；升温程序：开始时为140 ℃，以2 ℃/min，22.5 min升至185 ℃，保留5 min，以4 ℃/min，10 min升至 225 ℃，保留 3 min；载气（N2）压力：6.1 psi；氢气流速：30 mL /min，空气流速：300 mL/min；分流比：30∶1。脂肪酸百分含量用面积归一法确定（以峰面积百分比表示）。

1.3.6 数据处理

所有数据用平均数±标准差表示。采用SPSS11.0软件进行分析，采用单因素方差t检验进行组间比较，P＜0.05表示在统计学上具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 中老年SD大鼠大脑皮层MAO活性检测

各实验组SD大鼠大脑MAO活性数据如表1所示。

表1 各实验组SD大鼠大脑皮层单胺氧化酶酶活力原始记录数据

各实验组SD大鼠大脑皮层MAO酶活水平比较如表2所示。由表2可知，当向小鼠饲喂含DHA藻油和AA油脂混合油8周时，阳性对照组CK2的SD大鼠大脑皮层中的MAO活性相比于阴性对照组显著降低，当向小鼠饲喂含DHA、AA调配花生油8周时，低、中、高剂量调配花生油组SD大鼠大脑皮层中的 MAO活性与阳性对照组和阴性对照组相比，MAO活性均显著降低。临床上判断肝纤维化的程度，诊断肝硬化的重要指标之一就是MAO活性的高低，MAO活性增高，说明可能患有肝硬化和肝纤维化等疾病[21-22]。在摄入DHA和AA后，中老年大鼠大脑皮层中的MAO活性明显降低，表明DHA和AA的摄入有助于防止肝硬化和肝纤维化等疾病的发生。总的来说，机体肝硬化等疾病的重要指标之一为 MAO的活性高低的体现，随着机体DHA、AA摄入量的升高，MAO活性显著下降，说明该花生营养油能显著降低中老年SD大鼠体内MAO活性量，从而降低患肝硬化等疾病的风险。

表2 各组大鼠大脑皮层单胺氧化酶（MAO）酶活水平的比较（）

表2 各组大鼠大脑皮层单胺氧化酶（MAO）酶活水平的比较（）

注：#代表与空白组比较具有显著性差异（P＜0.01）；*代表与阳性药物组比较具有显著性差异（P＜0.01）。

组别 动物例数（n）/只MAO/（U/mg）阴性对照组CK1 7 540.00±67.12阳性对照组CK2 7 171.33±19.69#低剂量DHA、AA调配花生油组 7 405.92±40.19#*中剂量DHA、AA调配花生油组 7 319.74±19.00#*高剂量DHA、AA调配花生油组 7 248.59±40.16#*

2.2 中老年SD大鼠肝脏细胞形态结构观测结果

各组大鼠肝脏组织细胞切片如图1所示。图1中肝脏组织细胞的细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。

从图 1可以看出：阴性对照组中肝脏汇管区胆管及小叶间静脉扩张，纤维间质增生，伴有炎性细胞浸润。汇管区周围肝细胞水肿，空泡变性。阳性对照组为较正常肝小叶。处理1组中肝细胞广泛水肿，空泡变性伴气球样变，可见肝细胞核固缩，凋亡坏死。处理2组中肝细胞排列较密集，部分区域可见肝细胞水肿，胞浆空泡样改变。处理3组中肝细胞索排列稍紊乱，局部可见肝窦扩张淤血，肝细胞形态较正常。通过对中老年 SD大鼠肝脏的切片染色观察结果可知，灌喂花生营养油能有效改善中老年 SD大鼠的肝脏水肿及细胞炎症等症状，减缓细胞衰亡的速度，从而达到保护肝脏的作用。且DHA与AA含量越高，对肝脏的保护效果越明显。

图1 不同组中老年SD大鼠肝脏组织细胞切片图（200X）

2.3 花生营养油脂肪酸组成成分分析

花生营养油主要脂肪酸组成成分分析结果见表3。

由中老年SD大鼠大脑皮层MAO活性及肝脏细胞切片观测结果可知，饲喂高剂量 DHA、AA调配油组的 MAO活性最低，且肝细胞形态较正常。所以，采用高剂量组调配油中的比例，对花生营养油进行脂肪酸组成分析。从表3中可知，其ω6/ω3≈4.1，符合《中国居民膳食营养素参考摄入量》中建议的推荐值。这种油品不但具有花生油风味，而且具有更好的营养生理功能。同时，可使ω-3系多不饱和脂肪酸在总脂肪酸中所占比例增加，完善膳食中各类脂肪酸比例构成，使人体摄入营养更加均衡。

表3 花生营养油脂肪酸组成

3 结论

中老年 SD大鼠饲喂花生营养油，可显著降低SD大鼠中老年鼠大脑皮层中的MAO活性，且其活性与花生营养油中所含的DHA和AA含量呈正相关，在一定程度上能降低老年人肝硬化和肝纤维化等疾病的风险。根据对中老年 SD大鼠的肝脏组织切片染色观察结果可知，饲喂花生营养油可以有效改善中老年 SD大鼠的肝脏水肿及细胞炎症等炎症，减缓细胞衰亡的速度，从而达到保护肝脏的作用。

因此，在食用油中添加适量的DHA和AA，有利于增强大鼠肝脏抗肝硬化的能力以及抑制肝组织的过氧化程度。