毛细管电泳在手性化合物分离分析中的研究进展

刘明霞, 李向军, 白 玉, 刘虎威

(1. 北京分子科学国家实验室, 北京大学化学与分子工程学院, 北京 100871; 2. 中国科学院大学化学科学学院, 北京 100049)

手性是自然界和生命体中普遍存在的现象,从组成生物体的氨基酸、多糖、蛋白质等生物分子到人类所使用的药物,大部分都具有手性。手性化合物的对映体常具有相似的理化性质,但其在药学、生物学等领域往往呈现出不同的活性。比如一些手性药物的一个对映体具有药理活性,而另一个是无效的,甚至是有毒的。如R-沙利度胺具有缓解孕妇晨吐的功效,而S-沙利度胺则会导致婴儿畸形;S-布洛芬是高效非甾体解热镇痛药,而R-布洛芬基本没有药理活性[1,2]。生物体内的许多神经活性物质也具有手性,其对映体含量的变化与人体的健康状况密切相关。如正常情况下人体内D-乳酸的含量仅为L-乳酸的1%～5%[3],但在病理情况下,血浆中D-乳酸水平会显著增加[4]。在国际纯粹与应用化学联合会评选出的2019年度“化学领域十大新兴技术”中,与手性研究相关的“对映选择性有机催化”榜上有名。因此,建立高效的手性化合物分离分析方法对于医药、环境、生物、食品等诸多研究领域都具有重要意义。目前常用于手性化合物分离的方法有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、毛细管电泳法(CE)、超临界流体色谱法(SFC)等。相较于其他方法,CE以其分析时间短、分离效率高、分离模式多、运行成本低等诸多优势在手性分离领域发挥着越来越重要的作用[5]。CE的分离模式主要包括毛细管区带电泳(CZE)、毛细管电色谱(CEC)及胶束电动毛细管色谱(MEKC)等,按照分离原理不同,其应用范围也各有侧重。本文主要综述了近3年来这3种分离模式在手性化合物分离分析方面的应用,并对该领域今后的发展做了展望。

1 毛细管区带电泳

CZE是CE最基本、最常用的分离模式,其用于手性分离的主要原理为,在背景缓冲液中加入不同类型的手性选择剂,两个对映体与手性选择剂形成的络合物稳定性不同,使得表观迁移率产生差异,从而实现手性化合物的分离。近年来,用于CZE手性分离的选择剂越来越多样化,除了环糊精(CD)、冠醚、大环抗生素等传统手性选择剂外,手性离子液体、手性功能化纳米颗粒、生物分子等也在CE手性分离领域发挥了重要作用。

1.1 环糊精及其衍生物手性选择剂

在众多的手性选择剂中,CD及其衍生物仍然是CE手性分离中使用最多的手性选择剂。CD是由多个D-吡喃葡萄糖以1,4-糖苷键相连形成的环状低聚糖,天然CD主要有α-、β-和γ-CD 3种。对CD进行衍生化往往可获得更优的物理化学性质和更高的分离效能,因此CD衍生物在CE手性分离中的应用更为广泛。

Li课题组[6]以β-CD为手性选择剂,芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)为衍生剂,建立了CE-MS同时分离检测双手性神经递质分子3-羟基天冬氨酸的4种立体异构体的方法,并在小鼠脑脊液样品中检测到微量L-苏式-3-羟基天冬氨酸。该课题组[7]针对单一对映体价格昂贵、不易获取的现状,提出了利用CE与圆二色谱相结合进行峰归属的新方法,该方法无需单一标准品,成功用于3-羟基天冬氨酸4种异构体出峰顺序的确认。虞婕等[8]以β-CD为手性选择剂对抑霉唑进行手性拆分,同时采用堆积法在线富集,最优条件下富集倍数达91～92倍。Balint等[9]通过五步相转移催化法首次合成了七(6-O-甲基)-β-CD,将其用作CE手性添加剂分离亚甲基-二氧吡咯戊酮,取得了很好的分离效果。Sonnendecker等[10]利用设计的葡萄糖基转移酶实现了大量大环CD的合成,通过反相色谱分离可得到纯度大于90%的含有10～12个葡萄糖单元的大环CD,并将其作为手性选择剂用于氟伐他汀、氟甲喹羟哌啶、卡维地洛和伯氨喹4种手性药物的CE分离。结果表明,含有10个和11个葡萄糖单元的CD具有更好的分离效果。Cucinotta等[11]合成了一种新的赖氨酸-桥连的半球CD,利用赖氨酸残基将海藻糖加帽单元部分桥接至CD腔中,产生两个带有胺氮原子长链的受体,其电荷可以根据溶液pH值的变化轻松调节。将该赖氨酸-桥连的半球CD作为手性选择剂用于CE中,可成功分离5种手性药物分子。Patel等[12]以季铵-β-CD为手性选择剂,在堆积手性CE模式下,采用激光诱导荧光检测器增加检测的灵敏度,相比于正常CZE模式,该方法可将检测灵敏度提高480倍,成功用于单细胞中D-天冬氨酸和D-谷氨酸的检测。

为了提高分离效果,越来越多的研究利用含有CD的双选择体系来提高手性分离效果。Papp等[13]以磺丁基-醚-β-CD和γ-CD组成的双CD体系为手性选择剂,在CE中手性分离了兰索拉唑和雷贝拉唑两种质子泵抑制剂。Mu等[14]将共晶溶剂(DESs)作为添加剂加入到CD分离体系中,发现DESs的加入可将手性药物佐匹克隆、沙丁胺醇和氨氯地平的分离度提高3.0～4.2倍。Svecova等[15]在CE分离西替利嗪手性药物的过程中加入了D-葡萄糖,D-葡萄糖与硼砂形成的复合物可与磺化-β-CD形成双选择体系,从而将磺化-β-CD的用量减少15倍。Du课题组[16]首次建立了硫酸软骨素D/羧甲基-β-CD(CSD/CM-β-CD)双体系,将其加入CE背景缓冲液中,成功分离了6对碱性手性药物。分子对接研究表明,在CSD/CM-β-CD体系中R/S对映体与手性选择剂形成复合物的结合能差异以及氢键相互作用明显大于单CM-β-CD体系,CSD与CM-β-CD的协同作用提高了分离效果。Hu等[17]制备了β-CD的铜复合物(β-CDCu2),并将其作为手性添加剂实现了11对β-阻断剂的分离,分离效果优于单独使用β-CD。Men等[18]以γ-CD和Cu2+-D-苯丙氨酸组成的双体系为手性选择剂分离了西他沙星,在最优条件下,该方法可测定含量低至0.1%的西他沙星立体异构体杂质。

1.2 手性离子液体手性选择剂

离子液体是由正负离子组成的、在室温下呈液态的有机盐,具有电导率高、热稳定性好、不易挥发、易与水和有机溶剂混溶等优点。通过改变阴离子和阳离子的组合形式,可设计合成多种特定功能的离子液体。近几年,手性离子液体越来越多地应用于CE手性分离中,既可以作为手性选择剂单独用于CE手性分离,也可与其他多种类型的手性选择剂形成协同体系用于CE手性分离。

Du课题组[19]合成了四甲基铵-克林霉素磷酸离子液体，并用于CE中8对手性药物的分离,这是首次将抗生素类离子液体单独作为手性选择剂用于CE手性分离中。Sedghamiz等[20]利用杂化M06-2X密度泛函理论分析了普萘洛尔对映体与1-丁基-3-甲基咪唑(T-4)-双[(αS)-α-(羟基-O)苯乙酸根合-κO]硼酸盐离子液体形成复合物的电子结构和非共价键相互作用,证明了该手性离子液体在CE中的手性识别能力。

将离子液体与传统手性选择剂结合,已成为一种常见且有效的拆分体系。Du课题组[21]合成了3种氨基醇类手性离子液体N,N,N-三甲基-L-缬氨醇-双(三氟甲烷磺酰)亚胺、N,N-二甲基-L-脯氨醇-双(三氟甲烷磺酰)亚胺、N,N,N-三甲基-L-苯丙氨醇-双(三氟甲烷磺酰)亚胺,并与羟丙基-β-CD(HP-β-CD)一同用于CE中,分离了6种手性药物。结果表明,与单独使用HP-β-CD相比,加入氨基醇类离子液体后手性药物的分离效果显著提高。Zhang等[22]将6种氨基酸类手性离子液体与分离能力较弱的α-CD结合用于5种手性药物的分离,结果表明氨基酸类手性离子液体/α-CD协同体系可明显提高分离效果,其中四甲基铵-L-精氨酸/α-CD协同体系分离能力最强。Greno等[23]以γ-CD和手性离子液体R-N,N,N-三甲基-2-氨基丁醇-双(三氯甲烷磺酰)亚胺组成的协同体系为手性选择剂,分离了9-芴甲氧羰基氯-高半胱氨酸(FMOC-Hcy)对映体,最优条件下分离度可达3.8。核磁表征结果显示,FMOC-Hcy的疏水官能团插入γ-CD空腔内,离子液体也会进入CD的疏水空腔内与CD产生相互作用,从而增强分离能力。除了CD类手性选择剂,手性离子液体还可与抗生素、多糖等组成协同体系提高手性分离效果。Du课题组[24]利用四甲基铵-乳糖酸离子液体与克林霉素磷酸酯(CP)组成的双体系在CE中分离7种手性药物,相比于单独使用四甲基铵-乳糖酸或CP,四甲基铵-乳糖酸/CP协同体系的分离效果更好。该课题组还研究了糊精和两种环状离子液体(1-丁基-3-甲基咪唑(T-4)-双[(2S)-2-(羟基-κO)-3-甲基-丁酸根合-κO]硼酸和1-丁基-3-甲基咪唑(T-4)-双[(αS)-α-(羟基-κO)-4-甲基-苯乙酸根合-κO]硼酸)组成的双体系[25],麦芽糊精和两种氢基酸类手性离子液体(四甲基铵-D-泛酸和四甲基铵-D-奎尼酸)组成的双体系[26],以及麦芽糊精与氨基酸类离子液四甲基铵-L-精氨酸组成的双体系[27], 3种体系在CE分离中均表现出优异的协同分离能力。该课题组采用分子对接研究手性识别过程,结果表明手性离子液体能增强目标物与手性选择剂之间的氢键作用力。加入离子液体后,目标物与手性选择剂形成复合物的吉布斯自由能减小,结合更稳定,同时R/S-对映体与手性选择剂的结合自由能差变大,这些都说明手性离子液体在分离过程中起到关键作用。表1总结了近三年手性离子液体协同分离体系在CE手性分离中的应用。

1.3 其他手性选择剂

除了CD及其衍生物以及手性离子液体外,冠醚、抗生素、多糖、手性功能化纳米颗粒以及生物分子等在CE手性分离中均有应用。

Hagele等[33]以(+)-18-冠-6-四羧酸为手性选择剂,采用CE手段在15 min内分离了15对新型精神类手性药物。Lee等[34]以(18-冠-6)-2,3,11,12-四羧酸(18C6H4)为手性选择剂,建立了CE-MS手性分离17种氨基酸的方法,其中11对氨基酸可实现基线分离,监测离子为[氨基酸+18C6H4+H]+。Zhang等[35]和Jang等[36]分别以链霉素和强力霉素为手性选择剂,利用CE手性分离了多种酸性药物。张雪娇等[37]采用L-半胱氨酸(L-Cys)对金纳米颗粒(GNPs)表面进行修饰得到络合物L-Cys-GNPs,以该络合物为手性选择剂,采用CZE模式对盐酸异丙肾上腺素进行手性拆分,在7 min内分离度达到10.49。Liu等[38]则以链霉素修饰的GNPs为手性选择剂,7 min内分离了3种肾上腺素药物,分离度最大可达7.5。Naghdi等[39]以麦芽糊精为手性选择剂,在12 min内实现了曲马多和美沙酮的手性分离,并检测了其在药片、尿液和血浆中的浓度。Quintana等[40]合成了L-半胱氨酸和N-乙酰-L-半胱氨酸功能化的手性碳硅烷树枝状大分子,并将其作为手性选择剂加入到CE背景缓冲液中用于手性药物的分离,由于存在多个手性中心,该分子在手性分离丙亚胺时效果与CD相当。Tohala等[41]以DNA寡核苷酸为手性选择剂在CE中分离了几种手性分子,同时考察了序列长度、碱基对组成等对分离的影响,为设计有效的DNA手性选择剂提供了指导。陈丽等[42]以柠檬酸-Zn2+体系为非手性介质电泳运行液,采用非接触式电导检测器,分离检测了D,L-异亮氨酸对映体,其分离度可达2.0。

表 1 手性离子液体协同分离体系Table 1 Chiral ionic liquids synergistic separation systems

α-CD:α-cyclodextrin; HP-β-CD: hydroxypropyl-β-cyclodextrin.

2 毛细管电色谱

CEC是毛细管电泳与液相色谱相结合形成的一种微分离技术,该技术在手性分离领域发挥着重要作用。通过在毛细管柱内填充或键合手性固定相,以电渗流为驱动力,根据对映体在手性固定相和流动相之间分配系数及电泳淌度的不同实现分离。CEC色谱柱是该分离模式的核心,根据固定相在毛细管内的存在机制可分为填充柱、整体柱和开管柱。

2.1 填充柱

CEC填充柱是将色谱填料填充于毛细管内,并通过烧结柱塞将固定相保存于柱内的一种色谱柱。由于柱塞制备困难、重现性和选择性差、样品容量低等原因,填充柱的发展受到了一定的限制。

Fanali等[43]综述了多糖类手性固定相制备的填充柱在CEC模式下分离手性对映体的进展。近年来,Fanali课题组以直链淀粉修饰的二氧化硅为手性固定相制备了多种填充柱。该组将直链淀粉3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯共价结合于硅胶上,填充于100 μm内径的毛细管内制备填充柱,并对比了该填充柱在纳升液相色谱、CEC、压力辅助CEC中的应用[44]。结果表明,在分离8对手性黄烷酮衍生物时,压力辅助CEC下施加2.5 kV电压和1 MPa柱内压力时填充柱的柱效最高,分析时间少于20 min。该课题组[45]以3,5-二甲基苯氨甲酰化β-CD修饰的氨基功能化球形有序介孔二氧化硅为手性固定相,有效分离了手性黄烷酮及其甲氧基和羟基衍生物。D’Orazio等[46]将直链淀粉三(3-氯-5-甲基苯氨基甲酸酯)共价结合于二氧化硅上并填充于毛细管内用于分离中性及弱酸性手性化合物。对比纳升液相色谱和CEC两种微型分离技术的分离结果,CEC模式下可产生充足的电渗流,分离时间合理,分离效率更高。

2.2 整体柱

CEC整体柱是在毛细管内进行原位聚合制备得到的色谱柱。整体柱相比于填充柱,具有通透性好、传质速率快、重现性好等优点。

Xu等[47]合成了一种共价有机框架席夫碱网状物-1(SNW-1),并将其加入到基于纤维素酶(cellulase)的聚(甲基丙烯酸失水甘油酯(GMA)-共-乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA))中形成cellulase@poly(GMA-EDMA-SNW-1)整体柱。该整体柱用于分离8对不同类型的手性药物时表现出优良的对映体分离性能,这不仅得益于SNW-1的高表面积,而且还与SNW-1可提供共轭结构和丰富的氨基从而增加与待分析物之间的相互作用有关。Park课题组[48]以正丁醇锆为前体,磷酸克林霉素和红霉素的氨基甲酸酯化衍生物为共前体,通过原位溶胶-凝胶方法制备了手性有机-氧化锆杂化整体结构。该柱在非水相CEC模式下成功分离了6对酸性药物。该课题组[49]还制备了克拉霉素-氧化锆杂化整体柱,该柱可实现10对酸性手性药物的基线分离。

2.3 开管柱

CEC开管柱是将不同功能和形态的固定相涂覆或键合在毛细管内壁上形成的色谱柱。相比于整体柱和填充柱,开管柱不需要柱塞和颗粒填充,从而减少了气泡生成,也不需精确优化聚合物和致孔剂的比例,因此制备简单,操作方便。但开管柱也具有相比低、柱容量小的缺点,因此研究者通过管壁刻蚀技术、溶胶-凝胶技术、多孔聚合材料涂层技术以及在管壁内修饰纳米颗粒、石墨烯材料、金属有机框架材料以及生物材料等方式来增加涂层表面积从而增大相比和柱容量。

Feng等[50]通过可逆加成-断裂链转移聚合反应制备了4种嵌段共聚物,并将其涂敷于毛细管壁制成开管柱。其中共聚物顺丁烯二酸-苯乙烯-N-异丁烯酰基-L-组氨酸甲酯涂覆的开管柱效果最好,可与背景缓冲液中的游离配体L-组氨酸形成双体系,协同分离7对手性氨基酸。Guo等[51]以CuSO4/H2O2为引发剂实现了L-多巴在毛细管内壁的快速聚合和沉积,通过该方法制备的开管柱性能稳定,可实现手性胺类药物、神经递质和氨基酸等多种手性分子的分离。Li课题组[52]进行了有序介孔材料的制备及应用研究,成功合成了键合β-CD官能团、粒径大小分布均匀的球形介孔材料。以亮氨酸、脯氨酸对映体为分离对象,利用该材料进行CEC分离,结果表明所制备的β-CD修饰的有机-无机杂化材料有效提高了分离方法的选择性。

Du课题组[53]制备了β-CD和聚甲基丙烯酸缩水甘油酯纳米颗粒(PGMA-NPs)修饰的开管柱,主要步骤为先将GMA涂布于毛细管内壁形成触须状涂层,然后将分散聚合法制备的PGMA-NPs固定在涂层上,最后通过开环反应将乙二胺-β-CD共价结合到PGMA-NPs上。该开管柱相比于单层CD-PGMA和CD-GMA柱,在分离心得安、氨氯地平和美托洛尔3种对映体时表现出更为优越的性能。该课题组[54]还将β-CD和单-6-脱氧-6-(1-甲基咪唑)-β-CD甲苯磺酸盐修饰的磁纳米颗粒修饰到毛细管壁上,成功分离了6对丹酰氯(Dns)衍生的氨基酸。Zhou等[55]则制备了以巯基-β-CD-聚多巴胺-GNPs为固定相的开管柱,并用于7对手性药物的分离。Geng等[56]通过静电相互作用将沸石咪唑骨架材料(ZIF-8)修饰于毛细管内壁,以L-谷氨酸为手性配体,实现了D-、L-苯丙氨酸的基线分离。Pan等[57]合成了一种类似DNA双螺旋结构的均一手性沸石金属有机框架材料(ZMOF JLU-Liu23),将其作为固定相成功实现了4对手性一元胺神经递质的分离。Du课题组[58]通过共价作用将氧化石墨烯固定到毛细管内壁,以甲基-β-CD为手性选择剂,分离了萘普生、华法林和普拉洛芬3种手性药物,并通过分子对接模拟法研究分离过程。

将生物类大分子作为涂层制备开管柱用于CE手性分离也取得了不错的效果。Du课题组[59]以磷脂囊泡传递体为涂层材料制备了毛细管柱,加入羧甲基-β-CD后可实现3种碱性药物的分离,相比于未修饰的毛细管柱分离效果更好,说明传递体可有效提高手性分离效率。Fu等[60]首次将大肠杆菌作为固定相黏附于毛细管内壁,该开管柱可用于CE中分离氧氟沙星对映体。Sun等[61]制备了溶菌酶组装超分子膜涂布的毛细管柱,该柱手性分离效果较好,稳定性能优越,连续使用100次,分离效率没有明显下降,证明了基于黏附蛋白质超分子膜涂覆方法的可行性。

3 胶束电动毛细管色谱

MEKC作为毛细管电泳的重要分离模式之一,利用其进行手性分离时,被分离的对映体在手性胶束或非手性胶束与手性选择剂形成的准固定相上进行多次分配,从而达到分离的目的。

Perez-Miguez等[62]以茴二氧基硫酰氯(FLEC)为手性衍生剂,全氟辛酸铵为假固定相,在MEKC模式下6 min内分离了硒代蛋氨酸,分离度达到4.4。Morris等[63]探究了基于氨基酸的分子胶束聚(十一烷基-L-亮氨酸-亮氨酸钠)(poly(SULL))作为手性选择剂用于CE中手性分离6对手性化合物的机理。分子动力学模拟结果表明,poly(SULL)含有6个手性位点,分子内氢键在手性识别过程中起重要作用。Ghiasvand等[64]提出通过胶束和CD堆积作用富集分析物的方法,在该体系中堆积作用发生于十二烷基硫酸钠(SDS)和γ-CD交界面,SDS-CD复合物的形成导致包覆于SDS中的分析物释放,从而起到富集作用,其机理见图1。通过增加CD的进样时间,可实现扑尔敏和苯氧酸除草剂的手性分离。Prior等[65]将β-CD作手性选择剂,SDS作假固定相,成功分离了16对氯甲酸-9-芴基甲酯衍生的蛋白类氨基酸和12对茴二氧基硫酰氯衍生的蛋白类氨基酸,并通过荧光检测,实现了脑脊液中微量D-氨基酸的高灵敏检测。Creamer等[66]以γ-CD和牛黄胆酸钠胶束为背景缓冲液分离了13种5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯衍生化的中性手性氨基酸,以单独的γ-CD为手性选择剂分离了酸性手性氨基酸,利用建立的CE方法可区分非生物体系来源的氨基酸和生物体系来源的氨基酸。

图 1 手性胶束电动毛细管电泳模式下胶束-CD堆积机理[64]Fig. 1 Mechanism of micelle to CD stacking in chiral micellar electrokinetic chromatography[64] BGS: background solution(0.5 mol/L phosphoric acid, 0.2 mol/L sodium dodecyl sulfate); MCDS: micelle-to-cyclodextrin stacking; MEKC: micellarelectrokinetic chromatography.

4 结论与展望

截至目前,CE在手性化合物的分离分析中仍然具有不可替代的作用和应用前景。CD及其衍生物仍是应用最广泛的手性选择剂,与此同时,研究人员也在不断开发新的手性选择剂,其中手性离子液体在CZE模式中应用较多,新型手性功能化材料,如GNPs、金属有机骨架材料以及生物类大分子等在CEC模式下应用较多。此外,越来越多的研究采用分子模拟、核磁等手段对手性分离机理进行探究。未来CE在手性分析方面的研究仍将在以下几个方面展开:(1)开发特异性更强的新型手性选择剂、新型手性材料和生物类大分子等,建立高选择性的CE手性分离方法;(2)借助量子化学计算等理论手段以及核磁和质谱等先进仪器,深入探究手性分离机理,为新型手性分离方法的开发提供理论支持和指导;(3)扩展CE在食品、药品、环境、生命科学等领域的实际应用。