结合珠蛋白基因多态性与HBV相关性肝细胞癌易感性的关系分析

杨海娇，杨广民

(1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.吉林省人民医院医学检验中心，吉林 长春 130021)

HBV呈世界性流行，其在机体中的长期存在，是肝癌发生发展的重要条件。Hp是一种酸性糖蛋白，主要合成于肝脏，广泛存在于人类的血清及其他体液中[1]。人类Hp主要存在3种基因型：Hp1-1型、Hp2-1型和Hp2-2型[2]。由于Hp的基因多态性，近些年以Hp列为靶点探究其与疾病的关系，进而分析疾病病因及发病机制已成为一个重要课题。现选取在吉林省人民医院治疗的HBV-HCC患者，以健康体检者作为对照，对所有受检人员Hp基因型进行检测，以探究Hp的基因多态性与HBV感染相关肝癌的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料:随机选取2019年3月至12月在吉林省人民医院治疗的HBV-HCC患者98例，男81例，女17例，平均年龄61岁。纳入标准：①年龄>18岁；(2)肝癌符合《中国肝癌诊治指南》中的诊断标准，慢性乙型肝炎符合《慢性乙型肝炎防治指南》中的诊断标准。排除标准：①合并有HCV、HIV、梅毒、肝吸虫等其他病毒或寄生虫感染；②有严重心、肺、肾等重要脏器疾病。同时选取健康体检者104例作为对照。

1.2设备和试剂: Thermo Heraeus Fresco 17冷冻微量离心机，ABI PCR System 9700 PCR扩增仪，引物合成参照文献[3]，上游引物F1：5′-GCTGTCACTGCTGCGTAAAG-3′；下游引物R1：5′-GGTCAGTCTTTGGTTGGGTAG-3′；上游引物F2：5′-CCTGCCTCGTATTAACTGCACCAT-3′；下游引物R2：5′-CCGAGTGCTCCACATAGCCATGT-3′；由吉林省库美生物科技有限公司合成特异性引物，PCR扩增试剂盒由北京Promega生物技术有限公司提供，DNA提取试剂盒由天根生物工程股份有限公司提供，DNA Marker 由日本Takara公司提供。

1.3实验方法

1.3.1DNA提取和检测:留存HBV-HCC患者及健康体检者EDTA抗凝全血2 ml，严格按照DNA提取试剂盒说明书的操作要求从全血中提取基因组DNA。保存至-20℃条件下待用。

1.3.2PCR扩增PCR反应体系:应用PCR技术特异性扩增目的基因，体系包括模板DNA 2 μl，扩增缓冲液及DNA聚合酶12.5 μl，10 μM上下游引物mix 2 μl，加入无核酶水补至25 μl。第1步用上游引物F1和下游引物R1扩增Hp1的1757 bp产物和(或)Hp2的3481 bp产物，第2步用上游引物F2和下游引物R2扩增Hp2特异性的349 bp产物。引物F2和R2与引物F1和R1扩增体系相同。反应条件：引物F1和R1扩增时，95℃预变性2 min，95℃变性1 min，69℃退火并延伸2.5 min，共35个循环，末次循环后72℃充分延伸10 min，冷却至4℃。引物F2和R2扩增反应条件同上。

1.3.3Hp基因型的判定:取PCR扩增产物7 μl，依次点样于0.8%琼脂糖凝胶加样孔中，并点样相匹配的DNA Marker。电压100 V，电泳40 min。应用Tanon1600R全自动数码凝胶图像分析系统，在紫外灯下检测并摄像，通过观察电泳图，进行Hp基因型分型。

1.4统计学方法:基因计数法计算出等位基因频率。采用SPSS 21.0统计学软件，应用卡方分析处理分析数据。

2 结果

HBV-HCC患者组Hp1-1基因型频率为18.37%，Hp2-1为38.78%，Hp2-2为42.86%；健康人组Hp1-1基因型频率为7.69%，Hp2-1为34.62%，Hp2-2为57.69%。两组间Hp1-1基因型频率差异有统计学意义(P<0.05)；HBV-HCC组Hp1基因频率为37.76%，Hp2基因频率为62.24%；健康人组为25.00%，Hp2基因频率为75.00%。等位基因Hp1的基因频率升高明显，且两组间有显著性差异，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1104例健康人与HBV感染相关肝癌Hp基因频率比较[例(%)]

基因型例数(频率)健康人HBV-HCCχ2值P值Hp1-18(7.69)18(18.37)6.9050.032Hp2-136(34.62)38(38.78)Hp2-260(57.69)42(42.86)总Hp152(25.00)74(37.76)7.6500.006总Hp2156(75.00)122(62.24)

3 讨论

HBV的持续感染与肝癌密切相关。HBV是一种双链DNA病毒，其能将DNA整合入宿主细胞基因组内，从而诱发原发性肝细胞癌[4]。另外HBV会激发人体产生过度的细胞免疫反应，导致大规模的肝细胞损伤和严重肝炎。而此时患者的细胞免疫功能较弱，无法迅速有效得清除病毒，可能导致慢性感染，进而增加转变成肝癌的风险[5]。

Hp由一条含有439个氨基酸残基的单一多肽链组成。与免疫球蛋白的四肽链结构相似的是，Hp也含有两条轻链(α链)和两条重链(β链)，轻链又分为α1和α2两种，是使Hp具有基因多态性的主要原因。Hp有Hpl和Hp2两种等位基因，位于常染色体16q22上。人类Hp的3种基因型的分布存在种族和地区的差异性。在我国汉族人中，Hp2-2型最多，占55%左右；其次为Hp2-1型，约占35%；Hp1-1型最少，约10%左右。临床上针对Hp基因构造、表达、基因多态性研究尚不完善，仅讨论了等位基因Hp2在HBV-HCC中表达明显增高[6]。鉴于等位基因Hp2与HBV感染的相关性，考虑Hp基因多态性可能与HBV-HCC存在一定的关联，故将两者进行研究对比。而本次实验发现，HBV-HCC患者组Hp1-1基因型频率为18.37%；健康人组Hp1-1基因型频率为7.69%。两组间Hp1-1基因型频率差异有统计学意义(P<0.05)；HBV-HCC组Hp1基因频率为37.76%，Hp2基因频率为62.24%；健康人组为25.00%，Hp2基因频率为75.00%。等位基因Hp1的基因频率升高明显，且两组间差异有统计学意义(P<0.05)。这意味着与健康人相比Hp1基因在HBV-HCC患者中更为聚集，而不是等位基因Hp2。考虑可能有以下三种原因：(1)Hp1基因携带者对HBV-HCC有着更强的易感性；(2)在肝脏疾病中，癌前病变时Hp1基因就已经发生了集聚现象，这需要进一步研究来证实。(3)本次实验数据大多来源于吉林省患者，有一定的局限性，需要更多的数据来证明这一结论。

综上所述，等位基因Hp1与HBV-HCC有一定的关系，其存在可能更容易促使慢性乙型肝炎患者发展至肝癌阶段，需要更进一步的研究来完善这其中的发生发展机制。