DDX3 RNA 解旋酶在基因调控、肿瘤和 病毒感染中的功能

武 炜，孙英杰，丁 铲

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

DDX3是DEAD（D-E-A-D：ASP-Glu-Ala-Asp）-box解旋酶家族的成员，是一种从酵母到人的多种器官中均有发现的依赖ATP的RNA解旋酶[1]。DDX3有DDX3X（DBX）和DDX3Y（DBY）两种同系物，分别位于X染色体和Y染色体上[2]。DDX3X广泛表达于多种组织，而DDX3Y的表达仅限于雄性生殖染色体中，可能与雄性生殖有关[3]。DDX3参与RNA的多种代谢，例如转录、翻译、RNA剪接、RNA运输和RNA降解。最近研究发现，DDX3在基因表达调控、细胞周期调控、细胞凋亡以及抗病毒过程中均发挥作用。鉴于DDX3能够调控多种细胞通路，因此研究DDX3的调控机制对于了解细胞行使功能和发挥抗病毒反应至关重要。

1 DDX3 调控基因表达

1.1 DDX3参与基因启动子转录的调控DDX3已被证实能够调控多种基因的表达。一方面，DDX3对干扰素（interferon，IFN）β启动子和p21waf1/cip1启动子起正调节作用[4]；另一方面，DDX3对E钙黏蛋白启动子起负调节作用。染色体免疫沉淀实验证实DDX3与IFN-β和E钙黏蛋白启动子互作，说明DDX3能够直接调控两者的表达。

1.2 DDX3有助于RNA的核输出DDX3穿梭在细胞质和细胞核之间，与两种核运输的穿梭蛋白互作，即含有核输出信号（nuclear export signal，NES）的蛋白受体CRM1和作为mRNA输出的重要受体tip相关蛋白（tip-associated protein，TAP）[5]。DDX3可与CRM1互作并介导Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus typeⅠ，HIV-Ⅰ）Rev依赖的病毒mRNA核输出；干扰TAP会导致DDX3的核聚集，说明DDX3伴随信使核糖核蛋白（mRNP）通过TAP介导的通路从细胞核运输到细胞质[5]。

1.3 DDX3对调控翻译具有重要作用DDX3结合翻译起始因子eIF4E、eIF4a、eIF4G、eIF2a、eIF3和poly（A）结合蛋白（poly（A）-binding protein，PABP）等，促进5"端非翻译区（5" untranslated region，UTR）mRNA的翻译[5]。有报道显示DDX3的主要功能是通过与eIF3互作促进蛋白翻译，DDX3与eIF3和40s核糖体互作有利于功能性80s核糖体的组装[6-7]。酵母DDX3的同系物Ded1也能通过翻译起始因子eIF4F-mRNA复合物调控蛋白翻译。除了这些正调控机制之外，DDX3还能与Ago2互作，Ago2是一种干扰RNA通路的重要因子，可以切割目标mRNA；在应激条件下，DDX3存在于细胞质的应激颗粒中，通过稳定未激活翻译复合物中的eIF4E来阻止其与eIF4G互作从而抑制“加帽”依赖的翻译，表明DDX3可作为一种翻译抑制剂[8]；有研究证明：干扰DDX3对翻译没有显著的影响，因此DDX3对mRNA翻译非必需。这些结果说明DDX3可通过多种方式调控蛋白质的翻译[9]。

2 DDX3 调控细胞周期、细胞凋亡和肿瘤发生

DDX3调控细胞周期、细胞凋亡和肿瘤发生。研究发现，温度敏感型DDX3突变的仓鼠细胞系tsET24或者敲除DDX3的细胞，从G1到S细胞周期均被阻止[10]。这是由于一方面DDX3在细胞周期过程中通过调控翻译增强cycling E1的功能；另一方面，DDX3还能够通过抑制cyclin D1以及细胞生长来调节细胞周期[11]。在鼠早期胚胎中，DDX3也调控细胞的生存和细胞周期[12]。此外，DDX3与DDX5直接互作并且共定位于细胞质，这种共定位发生在细胞周期的G2/M期，说明了DDX3的定位和功能依赖细胞周期调控。

现已证明DDX3可引发乳腺癌，存在于香烟中中的二羟环氧苯并芘（benzo[a]pyrene diolepoxide，BPDE）可激活DDX3，促进乳腺上皮细胞的生长、增殖和肿瘤转变。与此发现吻合的是，DDX3的过表达可以诱导上皮间叶样转化并在软琼脂中形成菌落，显示DDX3移动性和迁徙性的增强，DDX3被招募到E钙黏蛋白启动子并且抑制E钙黏蛋白的表达，可引起细胞迁移和代谢功能增强[13]。DDX3可能通过促进转录因子Snail表达水平升高导致癌症的发生[14]，Snail可抑制细胞吸附蛋白的表达，致使不同类型癌症细胞迁徙性和代谢性增加。最近研究结果表明：DDX3在胆囊癌中的过表达与肿瘤的尺寸以及肿瘤、淋巴结和转移肿瘤（tumor, node and metastasis，TNM）的高表达、侵袭、淋巴结的转移有很大的关系，说明DDX3是胆囊癌的代谢和愈后不良的标志[15]。组织缺氧是实体瘤的主要特征，其很大程度上影响细胞和肿瘤组织的呼吸和代谢功能，低氧适应性基因的表达主要由去氧诱导因子（hypoxia inducible factors，HIFs）调控。DDX3在乳腺癌细胞中异常的表达使肿瘤侵袭由微弱表型扩散至强烈表型，HIF-1结合到DDX3启动子上可增强DDX3的表达，说明DDX3也是一种去氧诱导因子。

与以上结果截然相反的是：有报道证实DDX3是一种肿瘤抑制因子[16]，能够抑制许多细胞系克隆的形成，并下调cyclin D1和上调p21waf1/cip1启动子活性[11]。在肝癌细胞中，DDX3的表达明显受到抑制[11]DDX3的缺失可导致细胞分裂增加和凋亡减少。非活性状态p53能够诱导DDX3缺失，通过MDM2/Slug/E-cadherin通路促使肿瘤的恶化，最终导致非小细胞肺癌病人病情加重[17]。

DDX3具有抗凋亡和促凋亡的双重功能。研究发现死亡受体可以被一个包含GSK3、DDX3和cIAP-1的抗凋亡蛋白复合物“加帽”，因此DDX3具有抗凋亡的功能[18]。相反，DDX3与p53互作可正向调控DNA损伤诱导的凋亡[19]。此外，通过调控p53-DDX3通路引起p21waf1/cip1减少与人类早期乳头瘤病毒相关的肺癌复发型存活率有关[20]。肿瘤细胞中DDX3低表达/阴性表达与预后不良的临床特征有很大的关系，因此DDX3的低表达/阴性表达是口腔癌患者不良预后的标志[21]。

总之，DDX3有抑瘤和致瘤的双重特性。这可能与细胞模型相关，因此需要进一步研究DDX3在细胞增殖调控中的潜在功能，这些研究为接下来的癌症化疗药物研发提供新思路。

3 DDX3 作为病毒的靶点

DDX3已被证实是一些病毒的靶点，如丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）、HIV-1、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）、西尼罗病毒（West nile virus，WNV）、日本乙型脑炎病毒、诺瓦克病毒、牛痘病毒和巨细胞病毒等。DDX3能够促进某些病毒的复制（例如HCV和HIV-1），因此，DDX3可作为抗HCV和HIV-1病毒药物的治疗靶点；同时DDX3能够抑制HBV的复制，说明DDX3在不同病毒复制中发挥不同的作用。DDX调控病毒复制主要有以下几种机制：

3.1 DDX3在HCV复制周期中的作用丙型肝炎病毒是慢性肝炎的病原体，可导致原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）和肝硬化。HCV是9.6 kb单股正链RNA基因编码（～3000氨基酸残基）的有囊膜的多聚蛋白。这个多聚蛋白被宿主和病毒的结合物切割成了至少10个蛋白，依次为：核心蛋白（core）、包膜1（envelope 1，E1）、E2、p7、非结构2（non-structural 2，NS2）、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[22-23]。DDX3对HCV的复制至关重要[24]，在DDX3敲除的细胞中，HCV基因组RNA（HCV-O株，基因型1b）和复制子RNA的聚集被显著抑制。同样在DDX3敲除的细胞中，HCV感染（JFH1株，基因型2a）被抑制。

3.1.1 DDX3与HCV核心蛋白（core）互作 已经发现一些DEAD-box RNA解旋酶与HCV蛋白互作并且调控HCV的复制。通过酵母双杂交筛选实验已经确定，DDX3与HCV core互作[25]。这一互作由HCV核心蛋白N端59个氨基酸残基介导，结合到DDX3 C端的RS样的结构域，共定位于胞浆内核周围，HCV core是第一个被发现与DDX3结合的病毒蛋白。然而，没有研究表明DDX3-core互作对HCV复制和HCV有关的肝脏疾病有何影响。将位于JFH1毒株core N端结构域的单氨基酸突变能够完全阻断其与DDX3的互作，但突变对病毒RNA的复制没有显著影响，说明DDX3-core互作在HCV的生活周期中非必需[26]。与此相矛盾的研究结果表明HCV core 16-36位氨基酸过表达可抑制HCV的复制，然而过表达DDX3能够使core（16-36aa）促进HCV复制[27]。

以上结果表明，DDX3结合core对复制子稳定性至关重要，DDX3在HCV不同复制阶段影响病毒复制，但DDX3-core互作对病毒复制的影响还有待进一步证实。

3.1.2 HCV感染诱导DDX3重排 HCV核心蛋白是病毒的结构蛋白，形成病毒的核衣壳，同时是脂质颗粒（lipid droplets，LDs）的靶点，LDs是HCV生存的重要的胞浆中的细胞器。出芽是囊膜病毒生活周期中关键的步骤，HCV利用运输所需的胞内分选复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）系统作为出芽机制。P-小体在翻译、抑制和mRNA降解机制中发挥一定的作用[28]。HCV感染可干扰DDX3、DDX6、Lsm1、Xrn1、PATL1和Ago2 P-小体的形成并且不断地将它们重新分配到LDs周围的HCV产物位点上，说明HCV阻止LDs周围的P-小体复合物并调控HCV的复制和翻译[29]。机体感染HCV可不断地将DDX3重排到LDs周围的感染位点，并且DDX3与HCV核心蛋白共定位[29]；最近研究表明，DDX3在WNV、日本乙型脑炎、诺罗病毒和瘟病毒属中起重要作用。同样，P-小体复合物LSM1、GW182、DDX3、DDX6和XRN1也被招募到西尼罗河病毒（WNV）的复制位点并且对病毒复制起正向调控[12,30-31]。这些结果说明DDX3可能参与LDs介导的HCV的复制过程。

3.2 DDX3影响HIV-1的复制 HIV-1是引起获得性免疫缺陷综合征的病原。HIV-1是正链RNA逆转录病毒，可编码9种多肽、结构蛋白、种群特异性抗原（group specific antigen，Gag）、聚合酶（Pol）、囊膜蛋白（envelope，Env）和辅助蛋白Vif、Vpu、Vpr、Nef以及调控蛋白Tat、Rev。HIV的基因表达在转录水平上可由Tat结合到初期病毒的转录激活反应的（trans-activation responsive，TAR）RNA调控，在转录后水平上可由env基因与Rev反应元件（rev-responsive element，RRE）结合所调控[32]。由于包含内含子的宿主RNA在完全剪切之前无法离开细胞核，HIV-1需要逃避宿主的监测系统运输，将未剪接或部分剪接的病毒RNA到细胞质并且合成HIV-结构蛋白和辅助蛋白。对此，Rev包含一个富含亮氨酸的NES结构域可招募核输出受体CRM1[33]。当与RRE以及Ran-GTP结构后，CRM1形成细胞核输出受体复合物，Rev-CRM1-RRE-Ran-GTP复合物可将未剪接或部分剪接的HIV-1 RNA从细胞核运输到细胞质中。

3.2.1 DDX参与HIV RNA核输出 一些病毒可以携带其自身的RNA解旋酶从而促进它们病毒基因的复制，包括HCV、黄病毒、风疹病毒和甲病毒[34]，但是HIV-1不能编码自身的RNA解旋酶。因此，宿主RNA解旋酶参与HIV-1复制的多个过程，包括HIV-1 RNA的反转录、HIV-1 mRNA的转录，HIV-1 mRNA的核质运输和HIV-1 RNA的包装[35]。DDX3是第一个被发现参与HIV-1 RNA核输出的蛋白。DDX3是一个核质穿梭蛋白，其与CRM1结合并且定位于核膜孔。Rev与DDX3直接互作，DDX3的过表达增强Rev介导的核输出。相反，DDX3敲除或者突变的DDX3表达会显著抑制Rev功能和HIV-1复 制[36]。

除了DDX3，其他的DEAD-box RNA解旋酶，例如DDX1也与Rev结合并且有助于依赖Rev的RNA核输出[37]。DDX1通过N端结构域与Rev互作并促进RRE上的Rev寡聚化，说明DDX1参与组装起始复合物。因此，DDX1和DDX3相继在Rev依赖的RNA核输出起作用。首先，DDX1结合到Rev并且促进RRE上Rev的寡聚化。其次，寡聚化的Rev招募CRM1/DDX3复合物，这些复合物可以依次地运输具有RRE的HIV-1 RNA进入细胞质。除了DDX3和DDX1，研究发现RNA解旋酶（DDX5、DDX17、DDX21、DHX36、DDX47、DDX56以及RNA解旋酶A（RHA））与依赖Rev的核输出有关，表明一系列与Rev互作的DEAD-box RNA解旋酶（RNA helicase A，RHA）可共同调控HIV-1 Rev的功能[38]。

3.2.2 DDX3与Tat互作促进HIV-1 mRNA的翻译 另一方面，HIV-1 Tat激活HIV-1 RNA的合成。Tat结合到TAR RNA可招募宿主因子（例如p300/CREB结合蛋白（p300/CBP）、p300/CBP相关因子（p300/CBP-associated factor，PCAF）等。据报道沃纳综合征解旋酶（werner syndrome，WRN）和RHA是Tat的辅酶因子，可增强HIV-1基因表达[39]。除了WRN和RHA，DDX3可与Tat互作。当DDX3过表达或细胞应激状态下，Tat被靶向招募至细胞质应激颗粒中，说明Tat/DDX3复合物在翻译中可能起作用。Tat与翻译mRNAs互作并促进包含HIV-1 5"-UTR mRNA的翻译。因此，DDX3对于HIV-1基因组RNA的翻译至关重要。DDX3直接结合到HIV-1 5"-UTR并与eIF4G和PABP互作，但与细胞质RNA颗粒中重要的加帽结合蛋白eIF4E没有互作[40]，说明DDX3以非依赖eIF4E的方式促进HIV-1 gRNA的翻译起始。

3.3 DDX3限制HBV的复制HBV是造成慢性肝炎的病原，是造成全球范围内的肝硬化和HCC的主要杀手之一。HBV属于嗜肝病毒家族，包含3.2 Kb长的双链环状DNA基因组。虽然HBV是DNA病毒，但是HBV通过反转录复制其DNA基因组。HBV DNA在感染机体感染HBV时可转换为闭合共价环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），可作为病毒转录的模板。前基因组RNA（pregenomic RNA，pgRNA）结合HBV聚合酶被选择性地包裹至核衣壳。HBV聚合酶将pgRNA反转录后使其产生弛环状的双链DNA（relaxed circular DNA，RCDNA）。在衣壳化过程发生之后，HBV反转录完全发生在核衣壳内。

最近研究表明，DDX3特异性地结合到HBV聚合酶上并融入到核衣壳中[41]。与HIV-1和HCV（DDX3促进病毒复制）不同的是，DDX3能够抑制HBV的反转录[36]。另外，最近研究报道DDX3抑制HBV启动子的转录，但是DDX3的解旋活性对HBV转录没有影响。因此，DDX3被认为是HBV新的宿主限制因子。

4 DDX3 作用于抗病毒天然免疫

病毒感染机体后，通过激活NF-κB转录因子和干扰素调控因子（IFN regulatory factor，IRF）-3可引起宿主天然免疫反应，使得哺乳动物细胞中I型IFN产物释放[42-43]。与NF-κB相似，IRF-3在未感染的细胞中定位于细胞质中。病毒感染后，首先IRF3被IKKε和TBK1磷酸化，磷酸化的IRF-3形成二聚体转位至细胞核进而激活Ⅰ型干扰素。Ⅰ型干扰素（例如IFN-α和IFN-β）对抗病毒天然免疫防控至关重要。这些IFNs激活了JAK-STAT通路后可诱导干扰素刺激基因（IFN-stimulated genes，ISGs）的产生，使机体处于抗病毒状态。

有报道显示：DDX3参与抗病毒天然免疫信号通路复合物的形成并诱导Ⅰ型干扰素的产生[44]。DDX3通过与IKK（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit）或者TBK1（tank-binding kinase）[45]互作可促进IFN-β的产生。IKKε（IKK epsilon）将DDX3 102位的丝氨酸磷酸化后被IRF-3招募到复合物中。IKKε和TBK1是IRF3激活激酶，可诱导NF-κB和干扰素通路的激活。进一步发现DDX3被招募到IFN-β启动子上，说明DDX3是转录调控因子。此外，DDX3还与RIG-I和MDA5形成复合物，并结合到线粒体抗病毒蛋白（mitochondrial antiviral-signaling protein，MAVS）诱导IFN-β的产生，表明DDX3可以作为将连接病毒RNA与MAVS的病毒RNA的感受器和接头蛋白。

相反，病毒必须克服宿主细胞介导的抗病毒天然免疫。HCV NS3-4A蛋白酶切割MAVS阻止IFN-β的产生[46]。此外，HCV核心蛋白可干扰DDX3-MAVS的互作，抑制其介导的IFN-β信号通路。另外有研究结果显示DDX3结合到HBV Pol可限制HBV的复制。相反，HBV Pol作为病毒免疫逃逸蛋白可干扰DDX3与IKKε/TBK1的互作。同样，牛痘病毒蛋白K7也可通过靶向DDX3抑制IKKε/TBK1介导IRF3的激活从而阻止IFN-β的产生。感染人巨细胞病毒后，DDX3促进ZBP1/DAI DNA感受器依赖的干扰素信号通路[47]（图1）。

图1 DDX3 参与宿主抗病毒天然免疫调控Fig.1 The regulation of DDX3-mediated innate immunity

5 展望

DEAD-box RNA解旋酶是进化过程中保守的一类蛋白，包含众多成员。DDX3是迄今为止研究最深入的DDX之一。如上所论述，DDX3在基因表达调控、细胞周期调控、细胞凋亡以及抗病毒过程中均发挥作用。越来越多的研究显示，DDX3还参与了细胞内其他重要的生物学过程，例如细胞分化和死亡、脂类代谢等。重要的是，DDX3参与了多种病毒的复制过程，可以作为研发抗病毒药物重要的靶点。已有报道证实能通过制备特异性抑制剂靶向DDX3的解旋酶结合区域来实现广谱的抗病毒活 性[48]；DDX3参与抗病毒天然免疫应答信号通路，病毒可通过靶向DDX3抑制宿主细胞先天性免疫；目前关于动物病毒抑制DDX3介导的干扰素表达机制的研究很少，尤其是猪、禽类等，大部分动物体内DDX3介导的抗病毒信号通路调控机制尚不明确。通过对动物DDX3调控机制的探索，有望开发新的治疗靶点防治动物传染病。