维生素C对氨氮胁迫下大鳞鲃幼鱼存活及鳃抗氧化酶活性的影响

2020-02-06梁俊平覃宝利王宣朋蔺玉华丁辰龙吴学军

河南农业科学 2020年1期

梁俊平，张静，覃宝利，王宣朋，蔺玉华，丁辰龙,，吴学军

(1.河南师范大学水产学院/河南省水产动物养殖工程技术研究中心，河南新乡 453007；2.江苏省农业科学院宿迁农科所，江苏宿迁 223800)

大鳞鲃(Barbuscapito)隶属鲤形目、鲤科、鲃属，原产于乌兹别克斯坦的阿姆河，具有食性广、耐盐碱、抗逆性强、生长速度快、肉质鲜美等优良特征[1-2]。大鳞鲃于2003年被引进我国以后，在解决人工繁育和养殖技术难题的基础上，养殖产量逐年增加[3-4]。然而，在大鳞鲃苗种高密度培育中，大量残饵、粪便等易引起养殖水体氨氮含量升高，对大鳞鲃苗种成活率及质量造成了严重影响。

维生素C(Vitamin C，Vc)，又称抗坏血酸，是一种水溶性维生素，作为天然的抗氧化剂和免疫增强剂，通常被添加到饲料和水体中，以提高水产动物机体抗氧化酶活性，缓解氧化应激反应[12]，增强鱼体免疫力、抗病力[13]。研究表明，饲料中添加Vc能有效降低氨氮胁迫下圆斑星鲽(Veraspervariegatus)幼鱼[14]、青鱼(Mylopharyngodonpiceus)[15]血清抗氧化酶活性下降的幅度，增强其抗氨氮胁迫能力；水体中添加Vc能提高亚硝酸盐胁迫下匙吻鲟(Polyodonspathula)仔鱼的抗氧化能力[16]，缓解鲤鱼(Cyprinuscarpio)在运输、养殖过程中的氨氮胁迫反应[17]，提高普安银鲫(Carassiusauratus)胚胎及仔鱼的抗氧化酶活性[18]。由此可见，Vc添加到饲料或水体中都能缓解水产动物对胁迫因子的应激反应。但由于饵料在粉碎、挤压、加工、干燥及运输的过程中受温度、压力、水分等影响，常导致Vc的有效成分被破坏，保留率下降[19]。另外，水体氨氮含量过高会引起水产动物摄食量减少，导致饲料中的Vc不能被有效利用[20-21]。水体中加入Vc不受动物摄食影响，可直接被水产动物吸收进入体内而发挥作用。目前，在大鳞鲃苗种培育阶段，有关向水体中添加Vc缓解氨氮毒性作用的研究尚未见报道。鉴于此，以大鳞鲃幼鱼为研究对象，采用半静水试验法，研究氨氮对大鳞鲃幼鱼的毒性效应，并在此基础上直接向水体中添加Vc，揭示Vc对大鳞鲃幼鱼氨氮中毒的缓解作用，以期为培育高质量大鳞鲃苗种及生态健康养殖提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂

1.1.1 供试鱼与饲养条件大鳞鲃幼鱼取自江苏省农业科学院宿迁农科所水产养殖中心，试验前于室内水泥池暂养7 d。暂养期间，自然光照，水温(23.50±0.41)℃，pH值8.03±0.07，连续充氧，每天换水一次，换水量为总体水量的1/2，每天按照鱼体质量的3%投喂基础饵料3次，投喂时间分别为9:00、12:00、18:00，正式试验前停食24 h。

1.1.2 主要试剂超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-px)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)以及总蛋白测试试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；氯化铵(分析纯，纯度99.5%)购于上海苏懿化学试剂有限公司；Vc(分析纯，纯度99.7%)购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 氨氮对大鳞鲃幼鱼的急性毒性作用通过预试验，确定24 h内供试鱼100%死亡的最小氨氮质量浓度为38.12 mg/L，24 h内无死亡的最大氨氮质量浓度为28.52 mg/L。

根据预试验，按照等对数间距设置8个氨氮质量浓度，分别为28.52、29.98、31.21、32.49、33.88、35.32、36.89、38.12 mg/L，每个质量浓度组设置3个重复，每个重复20尾鱼，鱼体质量(3.71±0.60)g，体长(6.56±0.43)cm，试验水体30 L，试验时间96 h。试验期间，连续充氧，水温控制在(23.50±0.41)℃，pH值稳定在8.03±0.07，为保证水族箱内氨氮质量浓度的稳定，每12 h更换一次试验液，换液量为1/2，实时观察供试鱼的中毒症状，及时捞出死鱼，以防止水质变坏影响试验结果。

定时记录24、48、72、96 h内各组鱼的死亡数，计算各时间点的死亡率、全致死质量浓度、半致死质量浓度(LC50)、安全质量浓度(SC)及对应的非离子氨的质量浓度。

1.2.2 Vc对氨氮胁迫下大鳞鲃幼鱼死亡率的影响通过1.2.1试验，确定出大鳞鲃幼鱼在96 h全致死的最低氨氮质量浓度为32.49 mg/L，在此氨氮质量浓度胁迫下，向水体添加不同质量浓度的Vc，确定96 h内无死亡的Vc最小质量浓度为80 mg/L。

在96 h全致死的最低质量浓度32.49 mg/L氨氮胁迫下，设置9个Vc质量浓度梯度，分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80 mg/L，每个质量浓度设置3个重复，每个重复20尾鱼，鱼体质量(3.63±0.70)g，体长(6.16±0.80)cm，试验水体30 L，试验时间96 h。试验期间，连续充氧，控制水温稳定在(23.50±0.41)℃，pH值稳定在8.03±0.07，为保证水族箱内氨氮及Vc质量浓度稳定，每12 h更换一次试验液，换液量为1/2，实时观察供试鱼的症状，及时捞出死鱼，以防止水质变坏影响试验结果。

实时记录24、48、72、96 h各组鱼的死亡数，计算各个时间点的死亡率。

1.2.3 Vc对氨氮胁迫下大鳞鲃幼鱼鳃抗氧化酶活性的影响试验共分4组(对照组、胁迫组、2个Vc缓解组)，其中，对照组：0 mg/L氨氮+0 mg/L Vc，胁迫组：15.01 mg/L氨氮(1/2 96 h LC50的氨氮质量浓度)+ 0 mg/L Vc，Vc-50缓解组：15.01 mg/L氨氮+50 mg/L Vc，Vc-80缓解组：15.01 mg/L氨氮+80 mg/L Vc，每个质量浓度组设3个重复，每个重复随机放养40尾鱼，鱼体质量(3.98±0.71)g，体长(6.59±0.57)cm，试验持续96 h。试验期间水温控制在(23.50±0.41)℃，pH值稳定在8.03±0.07，于暴露后的24、48、72、96 h从每个质量浓度组随机捞出9尾鱼，取鳃组织，每3尾鱼的鳃组织样品混合为1个样品，液氮速冻后-80 ℃冷冻保存。

将鳃组织液氮研磨后，分成3份，每份准确称0.05 g于1.5 mL无菌塑料离心管中，按质量(g)∶体积(mL)=1∶9加0.45 mL 0.65%的生理盐水，4 ℃条件下2500 r/min离心10 min，吸取上清液转移至新的离心管中，即为粗酶液，4 ℃保存备用。

按照各酶活性说明书操作步骤，测定各样品SOD、CAT、GSH-px活性，结果以平均值±标准差表示。

1.3 数据分析

运用SPSS 22.0 进行单因素方差分析，两两比较采用Duncan’s检验。采用SPSS 22.0对大鳞鲃幼鱼的死亡率与氨氮质量浓度进行线性回归分析，得出回归方程。

2 结果与分析

2.1 氨氮对大鳞鲃幼鱼的毒性效应

2.1.1 氨氮胁迫对大鳞鲃幼鱼行为的影响大鳞鲃幼鱼从养殖水体移入氨氮水体后，在试验初期，低浓度组大鳞鲃幼鱼活动正常，无明显中毒症状；高浓度组大鳞鲃幼鱼表现出狂躁不安，撞壁，上下翻滚、打转，蹿游，痉挛等症状。氨氮质量浓度越高、胁迫时间越长，供试鱼中毒症状越明显。高质量浓度氨氮组从胁迫的第3小时开始陆续出现死亡现象，6 h后死亡速度明显加快，死亡幼鱼口和鳃盖张开，身体弯曲。

2.1.2 氨氮胁迫对大鳞鲃幼鱼死亡率的影响如图1所示，24 h内仅氨氮质量浓度为28.52 mg/L时大鳞鲃幼鱼未出现死亡，其余各质量浓度组均出现不同程度的死亡，大鳞鲃幼鱼在38.12 mg/L时出现100%死亡。同一氨氮质量浓度组，随着胁迫时间的延长，大鳞鲃幼鱼的死亡率也逐渐升高；在同一时间内，随着氨氮质量浓度的升高，大鳞鲃幼鱼的死亡率呈线性升高(表1)。大鳞鲃幼鱼在24、48、72、96 h死亡率达100%的最小总氨氮质量浓度分别为38.12、38.12、35.32、32.49 mg/L。

图1 氨氮对大鳞鲃幼鱼死亡率的影响Fig.1 Effect of ammonia-N on the mortalities of juvenile Barbus capito

表1 氨氮质量浓度与大鳞鲃幼鱼死亡率的关系Tab.1 The relationship between ammonia-N concentration and the mortality of juvenile Barbus capito

2.1.3 氨氮对大鳞鲃幼鱼的半致死质量浓度和安全质量浓度如表2所示，大鳞鲃幼鱼的24、48、72、96 h总氨氮半致死质量浓度分别为34.95、33.84、31.42、30.02 mg/L，对应的非离子氨的质量浓度为1.64、1.59、1.47、1.41 mg/L；安全质量浓度为3.00 mg/L，对应的非离子氨的质量浓度为0.14 mg/L。

表2 氨氮对大鳞鲃幼鱼的半致死质量浓度和安全质量浓度Tab.2 LC50 and SC of ammonia-N on juvenile Barbus capito

2.2 Vc对氨氮胁迫下大鳞鲃幼鱼死亡率的影响

如图2所示，在96 h全致死的最低质量浓度32.49 mg/L氨氮胁迫下，分别向水体添加0、10、20、30、40、50、60、70、80 mg/L Vc，大鳞鲃幼鱼在96 h内的死亡率分别为100%、55%、55%、43%、25%、5%、3%、3%、0，死亡率随Vc质量浓度的增加呈下降趋势。在氨氮胁迫的基础上，当水体未添加 Vc时,大鳞鲃幼鱼在96 h内的死亡率达100%；当水体添加10 mg/L Vc时，大鳞鲃幼鱼在96 h内的死亡率下降至55%；当Vc质量浓度增加到50 mg/L时，供试鱼在96 h内的死亡率仅为5%；当Vc质量浓度增加到80 mg/L时，供试鱼在96 h内的死亡率为0。

图2 Vc对氨氮胁迫下大鳞鲃幼鱼死亡率的影响Fig.2 Effect of Vc on the mortalities of juvenile Barbus capito under ammonia-N stress

2.3 Vc对氨氮胁迫下大鳞鲃幼鱼鳃抗氧化酶活性的影响

2.3.1 Vc对氨氮胁迫下大鳞鲃幼鱼鳃SOD活性的影响如图3所示，氨氮胁迫组SOD活性随胁迫时间的延长呈下降趋势，在胁迫的24～96 h显著低于对照组(P<0.05)。Vc-50缓解组，SOD活性在48～72 h与胁迫组无显著差异(P>0.05)，在24、96 h显著高于胁迫组(P<0.05)；与对照组相比，Vc-50缓解组SOD活性在48～72 h显著低于对照组(P<0.05)，在24、96 h与对照组无显著差异(P>0.05)。Vc-80缓解组，SOD活性在24～96 h显著高于胁迫组(P<0.05)，而与对照组无显著差异(P>0.05)，在24～72 h内均显著高于Vc-50缓解组(P<0.05)，在96 h与Vc-50缓解组无显著差异(P>0.05)。

不同字母表示不同组别间存在显著差异(P<0.05)，下同

Different letters indicate there is a significant difference (P<0.05) between groups, the same below

图3 Vc对氨氮胁迫下大鳞鲃幼鱼鳃SOD活性的影响
Fig.3 Effect of Vc on SOD activity in gill of juvenile

Barbuscapitounder ammonia-N stress

2.3.2 Vc对氨氮胁迫下大鳞鲃幼鱼鳃CAT活性的影响如图4所示，胁迫组CAT活性随胁迫时间的延长呈下降趋势，除24 h外，其余时间点均显著低于对照组(P<0.05)。各Vc缓解组，CAT活性除24 h以外，在48～96 h均显著高于胁迫组(P<0.05)；与对照组相比，各Vc缓解组CAT活性在24 h显著高于对照组(P<0.05)，在48 h与对照组无显著差异(P>0.05)，在72～96 h显著低于对照组(P<0.05)。Vc-80缓解组CAT活性与Vc-50缓解组相比，在24～96 h均无显著差异(P>0.05)。

图4 Vc对氨氮胁迫下大鳞鲃幼鱼鳃CAT活性的影响Fig.4 Effect of Vc on CAT activity in gill of juvenile

2.3.3 Vc对氨氮胁迫下大鳞鲃幼鱼鳃GSH-px活性的影响如图5所示，胁迫组大鳞鲃幼鱼鳃GSH-px活性随着胁迫时间的延长呈下降趋势，在48～96 h显著低于对照组(P<0.05)。Vc-50缓解组，GSH-px活性在48～96 h显著高于胁迫组(P<0.05)，在24、96 h与对照组无显著差异，在48、72 h显著低于对照组(P<0.05)。Vc-80缓解组，GSH-px活性在48～96 h内均显著高于胁迫组(P<0.05)，在96 h内与对照组均无显著差异(P>0.05)。与Vc-50缓解组相比，Vc-80缓解组GSH-px活性在48～72 h显著高于Vc-50缓解组(P<0.05)，在24 h和96 h与Vc-50缓解组无显著差异(P>0.05)。

图5 Vc对氨氮胁迫下大鳞鲃幼鱼鳃GSH-px活性的影响Fig.5 Effect of Vc on GSH-px activity in gill of juvenile

3 结论与讨论

3.1 氨氮胁迫对大鳞鲃幼鱼行为及存活的影响

氨氮是水产养殖中常见的环境胁迫因子，对水产动物具有严重的毒性作用[5-11]。本试验结果显示，大鳞鲃幼鱼由自然水体移入高质量浓度氨氮水体后，表现出狂躁不安、上下翻滚、打转等症状，氨氮质量浓度越高或胁迫时间越长，大鳞鲃幼鱼中毒症状越明显，死亡率越高。这与卡拉白(ChalcalburnuschalcoidesAralensis)[22]、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[23]、黄颡鱼(Pelteobagrusvachelli)[24]、异育银鲫(Allogynogeneticgibelcarp)[25]、泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)[26]等的氨氮毒性结果相似。但是，不同鱼类对氨氮的耐受能力存在一定差异，如体质量3.71 g的大鳞鲃幼鱼(SC为3.00 mg/L)的耐氨氮能力与体质量3.52 g的黄颡鱼(SC为5.17 mg/L)[24]、体质量0.69 g的异育银鲫(SC为15.80 mg/L)相比较弱[25]，这可能与物种差异、个体大小及生存环境有关。氨氮胁迫引起大鳞鲃幼鱼中毒甚至死亡的原因，可能是由于水体中高质量浓度氨氮通过呼吸作用进入鳃，引起鳃组织内自由基含量增加，随着胁迫时间的延长，大量的自由基在鳃组织内累积，造成鳃组织损伤、坏死，鳃渗透压调节、排泄功能受损；另外，非离子氨进入血液后，将血红蛋白中Fe2+氧化为Fe3+，使血液载氧能力下降，进而导致鱼类窒息、死亡[7,27-28]。

3.2 氨氮胁迫下Vc对大鳞鲃幼鱼死亡率的影响

本研究结果显示，在96 h全致死的最低质量浓度32.49 mg/L氨氮胁迫下，分别向水体添加0～80 mg/L Vc，大鳞鲃幼鱼在96 h内的死亡率从100%下降到0，死亡率随Vc质量浓度的增加呈下降趋势。在氨氮胁迫的条件下，向水体添加10 mg/L Vc时，大鳞鲃幼鱼在96 h内的死亡率下降至55%；当Vc质量浓度增加到50 mg/L时，供试鱼在96 h内的死亡率仅为5%；当Vc质量浓度增加到80 mg/L时，供试鱼在96 h内的死亡率为0。李勇男[17]的研究也显示，在96 h全致死质量浓度145 mg/L氨氮胁迫下，向养殖水体中添加0、5、10、15、20、25、30 mg/L Vc，在96 h内，鲤的死亡率分别为100%、100%、80%、66%、40%、20%、0，呈下降趋势。氨氮胁迫下，向水体添加Vc，大鳞鲃幼鱼死亡率下降的原因，可能是由于Vc通过鳃扩散进入血液循环，在机体内不断累积，发挥抗氧化作用，清除自由基，增强了机体应对不良环境因子胁迫的能力，从而提高了存活率[17-18]。

3.3 氨氮胁迫下Vc对大鳞鲃幼鱼鳃抗氧化酶活性的影响

当鱼体暴露于高质量浓度氨氮环境中，其鳃与外界环境直接接触，是最先被氨氮侵袭的器官，极易受到扩散的非离子氨的损害，引起自由基含量升高[17,28]。在长期的进化过程中，生物体为防止氧自由基对机体造成损伤，保持其内环境平衡，逐渐形成了特定的抗氧化防御系统，主要包括酶系统(SOD、CAT、GSH-px)和非酶系统(维生素C、维生素E等)，其中抗氧化酶SOD、CAT、GSH-px的活性是反映机体健康与否的重要指标[29-31]。研究发现，当泥鳅暴露于1/2 96 h LC50(250 mg/L)氨氮溶液中21 d后，其鳃SOD和GSH-px活性随胁迫时间的延长呈显著下降趋势[28]；福瑞鲤幼鱼暴露于10、20、30 mg/L氨氮溶液(96 h LC50为35.6 mg/L)中96 h，其鳃SOD和总抗氧化酶活性均显著低于胁迫组[32]。本研究也显示，大鳞鲃幼鱼暴露于1/2 96 h LC50(15.01 mg/L)的氨氮溶液中96 h，其鳃SOD、CAT、GSH-px活性随胁迫时间的延长呈下降趋势，与上述研究结果相似。大鳞鲃幼鱼鳃抗氧化酶活性下降的原因，可能是大鳞鲃幼鱼暴露于氨氮环境中，水体中非离子氨扩散进入鳃，引起鳃自由基含量增加，为防止自由基对机体造成损伤，诱导自身抗氧化酶参与清除自由基[33]，但机体抗氧化系统具有一定的耐受限度，当水体氨氮质量浓度过高或胁迫时间过长，鳃组织内自由基得不到及时有效清除而过量积累，抗氧化系统被破坏，抗氧化酶活性下降[28]。