斑翅果蝇寄生蜂果蝇锤角细蜂大量饲养过程中寄主蛹分离方法的比较

陈 湜, 张沁园, 刘旭祥, 郑敏琳, 季清娥*

(1.闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室， 福建福州350002；2.教育部生物农药与化学生物学重点实验室， 福建福州350002；3.福建农林大学作物病虫生物防治研究所， 福建福州350002)

斑翅果蝇(Drosophila suzukiiMatsumura)隶属于双翅目果蝇科,是世界范围内蓝莓、杨梅、葡萄、樱桃等软皮水果的重要害虫(Asplenet al,2015)。 果蝇锤角细蜂(Trichopria drosophilaePerkins)属膜翅目锤角细蜂科,是斑翅果蝇蛹期的主要寄生蜂之一,极具生物防治应用潜力(Gonzalez-Cabreraet al,2019；Ibouhet al,2019；Pfabet al,2018；Stacconiet al,2018)。 果蝇锤角细蜂的寄主范围较广,可寄生多种果蝇,但对斑翅果蝇有寄生偏好(Yiet al,2020)。 在这些寄主中,与斑翅果蝇同属于黑腹果蝇种组的黑腹果蝇(Drosophila melanogasterMeigen)是遗传学中的模式昆虫,具有体型小、繁殖快、生长周期短、易于人工饲养等特性,适于作为果蝇锤角细蜂大量饲养的替代寄主(胡玮等,2019；仪传冬等,2019)。

本研究发明了一种快速大量收集黑腹果蝇老熟幼虫的装置,可获得大量同日龄的蝇蛹供果蝇锤角细蜂寄生(陈湜等,2020a,2020b)。 但黑腹果蝇的老熟幼虫体表和初化蛹的蛹表面具有粘液,蛹通常粘附于容器壁上或彼此黏连。 在大量收集后,蛹容易黏结成团。 彼此黏连一团的蛹在数粒仪中常常会被错误识别为单粒蛹,而且会影响蛹寄生蜂搜寻寄主,从而影响寄生蜂的饲养。 同时,在寄生蜂大量饲养过程中,不但需要对蝇蛹进行定量,以维持合适的寄生蜂与寄主比例,还需要分离寄生蜂的蛹和寄主的蛹,但其黏结在一起,影响分离。 综上所述,如何避免黑腹果蝇老熟幼虫和蛹相互黏连,是果蝇锤角细蜂大量饲养过程中的一个关键问题。

对于黏连的黑腹果蝇蛹,可行的分离手段有：加入不同的润滑物质,轻柔揉搓,用清水洗除蛹表面的粘液等。 本研究分别采用直接揉搓法、滑石粉法、玉米淀粉法、水洗法4 种方法分离黑腹果蝇蛹,并测定这些分离方法对黑腹果蝇蛹的自动计数、果蝇锤角细蜂搜寻寄主、黑腹果蝇的羽化、蛹壳和蜂蛹的分离、果蝇锤角细蜂的羽化5 个方面的影响,以期筛选出最适于果蝇锤角细蜂大量饲养中黑腹果蝇蛹的分离方法。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

试验所用野生型黑腹果蝇,2017 年采自福建省福州市,已在福建农林大学作物病虫生物防治研究所实验室连续饲养30 代以上。 饲养条件：温度(23±1) ℃,相对湿度75%±5%,光周期12 h ∶12 h(L ∶D) 。 采用陈湜等(2020a,2020b)的方法饲养和收集老熟幼虫。

试验所用斑翅果蝇寄生蜂果蝇锤角细蜂,2017 年采自福建漳州杨梅园,已在福建农林大学作物病虫生物防治研究所实验室连续饲养30 代以上。 饲养条件：温度(23±1) ℃,相对湿度75%±5%,光周期 12 h ∶12 h(L ∶D) 。

1.2 试验材料

试验所用主要试剂：滑石粉、玉米淀粉(食品级,市售)。 试验所用仪器：SLY-A 微电脑自动数粒仪(杭州绿博仪器有限公司)；谷物吹壳器(购自淘宝聚鹦缘鹦鹉生活馆)。

1.3 果蝇蛹的分离

用软毛笔挑取500 头黑腹果蝇老熟幼虫,以纸巾包裹,在黑暗环境下静置24 h,待老熟幼虫化蛹、并且蛹表面的粘液干燥后,用4 种不同的方法进行分离。 以未经分离的蝇蛹和手工逐一分离的蝇蛹为对照组。

直接揉搓法：以手指隔着纸巾轻搓至基本分离,打开纸包,将蝇蛹平摊于滤纸上。

滑石粉法：在包裹蛹的纸巾内撒入1 mL 滑石粉,振荡后,以手指隔着纸巾轻搓至基本分离。 将蝇蛹倒在筛孔尺寸为0.600 mm 的筛网上,轻轻抖动,筛去多余的滑石粉。 将蝇蛹平摊于滤纸上。

玉米淀粉法：与滑石粉法步骤相同,但将滑石粉替换为等量的玉米淀粉。

水洗法：将蝇蛹放置于筛孔尺寸为0.600 mm 的筛网上,用无菌水漂洗至蝇蛹完全分离。更换无菌水,重复3 次。 倒扣筛网,将蝇蛹抖落在滤纸上,尽量摊散,于通风避光处阴干,而后将蝇蛹放置于纸巾上,以手指隔着纸巾轻搓至基本分离。

阴性对照：在500 头老熟幼虫化蛹,并且蛹表面的粘液干燥后,直接打开包裹的纸巾,将蝇蛹尽量摊散于滤纸上。

阳性对照：在500 头老熟幼虫刚化蛹,蛹表面粘液还未干燥时,用细毛笔逐一挑取蝇蛹,彼此隔开一段距离放置于滤纸上避免黏连,并于通风避光处晾干。

1.4 蝇蛹数量的测定

黑腹果蝇蛹依照上述方法分离处理后,静置24 h。 依照自动数粒仪的操作说明对蝇蛹进行数粒。 每个处理均设置3 个重复。

1.5 果蝇锤角细蜂的寄生

黑腹果蝇蛹依照上述方法分离处理后,静置24 h,供果蝇锤角细蜂寄生。

组一：取同日羽化的250 头雌、100 头雄果蝇锤角细蜂,共350 头,放入23 cm×16 cm×16 cm的养虫罐内,以插有棉芯的锥形瓶,盛装有无菌水和充分吸收蜂蜜的医用脱脂棉球进行饲养。由于果蝇锤角细蜂的怀卵量和产卵量在前4 天会逐渐上升(Wanget al,2016；Yiet al,2020),因此,在饲养至第5 天时,将放有500 粒蝇蛹的滤纸提供给果蝇锤角细蜂,寄生24 h 后取出。每处理均设置3 个重复。

组二：取同日羽化的100 头雌、40 头雄果蝇锤角细蜂,共140 头,以同样方法饲养至第5 天。 将放有500 粒蝇蛹的滤纸提供给果蝇锤角细蜂,寄生24 h 后取出。 每处理均设置3 个重复。

1.6 分离寄主蛹壳和尚未羽化的蛹

将组二寄生后的蛹分别放置于纱网封口的养虫罐中,寄生后的第5 天,未被寄生的黑腹果蝇全部羽化并饥渴而死。 采用谷物吹壳器分离未被寄生的寄主羽化后的蛹壳和尚未羽化的蛹。 对于每个处理,均采用下述的方法获得相应的最适风速：(1)风选机远槽为暂存槽,近槽为好料槽,从50%风速开始做多轮风选,每轮风速以2%步进。 (2)每轮风选后,统计暂存槽中的未羽化蛹和蛹壳数,判断比例,若暂存槽内的未羽化蛹数≤暂存槽内的蛹壳数,则将暂存槽内的蛹和蛹壳都倒入废料容器,使用好料槽的内容物来进行下一轮风选；若暂存槽内的未羽化蛹数＞暂存槽内的蛹壳数,则将暂存槽内的蛹和蛹壳都倒入好料槽,并停止风选。 (3)分别统计废料容器和好料槽中的未羽化蛹数和蛹壳数,计算错分率。

1.7 果蝇锤角细蜂寄生率、出蜂率和寄生蜂与果蝇的总羽化率的测定

当组一、组二的寄主全部羽化并饥渴而死后,统计羽化的黑腹果蝇数目。 将寄主分离后手工分拣出的未羽化蛹分别放置于纱网封口的养虫罐中,直至不再有新的寄生蜂羽化为止,统计寄生蜂的数目。 此时将尚未羽化的蛹在水中泡开后,在体视镜下解剖以确定是否为寄生蜂蛹。由于果蝇锤角细蜂的平均日产卵量为2～4 粒(Wanget al,2016),本试验将组一得到的数据用于在寄生蜂过量存在的前提下,计算充分寄生时的寄生率；而组二得到的数据则用于在寄主果蝇蛹过量存在的前提下计算出蜂率和总羽化率,以尽可能地排除过寄生的影响。 其中,寄生率用于评估不同处理对寄生蜂搜寻寄主和寄生过程的影响,出蜂率用于评估不同处理对寄生蜂发育和羽化的影响,而寄生蜂和果蝇的总羽化率用于评估不同处理对蝇蛹的损伤程度。

1.8 统计分析

本试验用SASJMP 9.0 进行统计分析,分别计算每个处理的平均值和标准误,并采用LSD-t检验比较各处理之间的差异。

2 结果与分析

2.1 不同分离方法对蝇蛹计数的影响

由表1 可知,自动数粒仪对阳性对照组的计数准确率达到93.86%±0.00%。 试验中观察到,当2 粒蛹随机地一同通过自动数粒仪的光电窗时,会被识别为单粒蛹,因此自动数粒仪的计数总是稳定地小于实际数目。 而阴性对照组的准确率最低,仅为42.20%±0.04%。 粘结成团的多粒蝇蛹会被自动数粒仪识别为单粒,同时团粒数量的随机性导致了计数的不稳定。 因此,粗略计数可以间接反映蛹的分离效果。

表1 分离方法对自动计数准确率的影响Table 1 Effect of pupae separation methods on automatic counting accuracy

在4 种分离方法中,直接揉搓法的自动计数准确率仅高于阴性对照,表明直接揉搓无法较好地分离粘结的蝇蛹。 滑石粉法和玉米淀粉法的计数准确率无显著差异,二者均显著高于水洗法,并低于阳性对照。 在试验中观察到,由于水的表面张力,经水洗后的蛹更倾向于沿长轴方向平行相靠,并在干燥后两两黏连在一起,且轻柔揉搓对于破坏这种黏连的效果不佳。 因此,粉状润滑剂对蝇蛹的分离效果更优。 经2 种粉状润滑剂分离后的蝇蛹自动计数准确率分别为85.40%±0.01%和85.40%±0.02%,约为阳性对照的91%,且数值较为稳定。

2.2 不同分离方法对蛹壳和未羽化蛹的风选分离效率的影响

由表2 可知,所有处理中,错分到蛹壳中的未羽化蛹数均高于错分到未羽化蛹中的蛹壳数。使用谷物吹壳机风选阳性对照组的错分率仅1.07%±0.08%。 而阴性对照组的错分率最高,达到10.27%±0.38%,表明蛹和蛹壳的彼此黏连对风选的影响较大。 试验中观察到,当未羽化蛹和蛹壳成团黏连时,若团粒中蛹壳比例相对较大,则会被分到蛹壳一侧,反之则会被分到未羽化蛹一侧,造成错分。 在4 种分离方法中,直接揉搓法的错分率仅低于阴性对照,与计数试验的结果一致。 滑石粉法、玉米淀粉法和水洗法的错分率无显著差异,均显著高于直接揉搓法,低于阳性对照。 经这3 种方法分离后的黑腹果蝇蛹壳和未羽化蛹风选错分率均低于5%。

表2 分离方法对蛹壳和未羽化蛹的风选分离效率的影响Table 2 Effect of pupae separation methods on the winnowing separation efficiency of host puparium and unemerged pupae

2.3 不同分离方法对果蝇锤角细蜂寄生率、出蜂率和寄生蜂与果蝇的总羽化率的影响

由表3 可知,阳性对照组的寄生率极显著高于阴性对照组,但二者的出蜂率和寄生蜂与果蝇的总羽化率均无显著差异。 这表明,在寄生蜂过量的情况下,蝇蛹的黏连对人工大量饲养条件下的寄生率有影响,原因是果蝇锤角细蜂的产卵器短小,无法接触到位于黏结团粒中心的蝇蛹,从而影响寄生率。 但蛹的自然黏连不影响黑腹果蝇和果蝇锤角细蜂的发育和羽化。 在4 种分离方法中,除直接揉搓法外,其他几种不同分离方法下的寄生率和出蜂率均与阳性对照无显著差异。这表明在现有的饲养条件下,水洗和粉末对蛹表面性质的改变并不影响寄生蜂寻找寄主和寄生的行为,同时也不影响寄生蜂在寄主蛹内的发育和羽化。 直接揉搓法组的寄生率、出蜂率和寄生蜂与果蝇的总羽化率均是最低的,表明揉搓损伤了蛹,导致蛹包括寄生蜂不能继续发育。 其他几种分离方法影响不显著的原因可能是：在粉状润滑剂存在,或已水洗去除粘液的情况下,蝇蛹之间的粘结较为松散,只需轻轻揉搓,短时间即分开；且润滑剂的存在起到了一定的缓冲作用。

表3 分离方法对寄生率、出蜂率和寄生蜂与果蝇的总羽化率的影响Table 3 Effect of pupae separation methods on the parasitism rate, emergence rate of Trichopria drosophilae,and total emergence rate of T.drosophilae and D.melanogaster

3 结论与讨论

本试验中阴性对照组和阳性对照组之间的差异显著,表明黑腹果蝇蛹的黏连对自动数粒、风选分离、蛹寄生蜂的寄生率均有较大的影响,是大量饲养中亟待解决的实际问题。 通过比较4 种分离方法对果蝇锤角细蜂大量饲养过程中5 个环节的影响,结果表明,直接揉搓法对黑腹果蝇蛹的分离效果相对较差,且揉搓过程对蛹造成的机械损伤明显影响羽化率,从而降低了果蝇锤角细蜂的生产效率,不适于生产应用。 水洗法的分离效果略差于滑石粉法和玉米淀粉法,但三者在其他环节的表现无显著差异。 然而,水洗法的工序在三者之中最为繁琐,且阴干过程耗费的时间较长。 胡玮等(2019)利用水流冲洗收集黑腹果蝇的蛹阴干后供寄生,在收集的同时能够有效地分离蝇蛹。 但在应用陈湜等(2020a,2020b)的方法时,自动大量收集蝇蛹的前提下,滑石粉法和玉米淀粉法显然更加简便易行。 滑石粉法和玉米淀粉法在各个环节均表现出了仅次于阳性对照的良好效果,且二者之间没有显著差异。 滑石粉价格较玉米淀粉更为低廉。 它具有良好的疏水性、润滑性和抗粘性,作为润滑辅料广泛应用于工业生产中(殷代武等,2013)。 但是,滑石粉具有致癌性,且吸入滑石粉会对肺部造成损害,因此医疗、日化行业普遍以玉米淀粉替代滑石粉(Garlichet al,2011；Mac Quiddyet al,1948)。 因此建议,在劳保措施较为完善的工厂化大量生产中可以考虑使用滑石粉降低成本,而在实验室大量饲养中则可以使用更加安全的玉米淀粉。 但是,本研究尚未对滑石粉和玉米淀粉的用量、搓捻力度和搓捻时间作定量分析。 在今后的研究中,可以设置梯度进行比较,找到分离效率相对高、对蛹的损伤相对小的最佳方案,并在此基础上进一步将之机械化、自动化,以更加适应工厂化大规模生产果蝇锤角细蜂的需要。

本试验首次尝试应用自动数粒仪对黑腹果蝇蛹进行计数。 结果表明,市售SLY-A 型自动数粒仪对阳性对照组黑腹果蝇蛹的计数准确率仅有93%,远低于对小颗粒种子计数的0.4%误差。 这是由于黑腹果蝇蛹的横截面直径小于0.5 mm,超出该款数粒仪的设计应用范围,使得两粒蛹可以同时落下,导致漏检。 在今后的研究中,可以通过改造自动数粒仪载料盘上的缺口形状和改变入料通道的坡度来提高计数的准确度。 本试验中,阳性对照组的标准误低于0.01%,表明这类由仪器不适配导致的误差是相当稳定的。 考虑到在实际应用中可以将数据乘以一个由经验得来的系数,以使之更加贴近实际数值,因此认为,在对精确度要求不高的情况下,目前市售的自动数粒仪也适用于大量生产中黑腹果蝇蛹的计数。

未被寄生的寄主羽化后残余的蛹壳和寄生蜂蛹的自动风选分离已在多种实蝇类害虫中获得成功(Jacksonet al,1996)。 果蝇锤角细蜂的平均羽化时间较黑腹果蝇的羽化时间晚10 d 以上(Wanget al,2016)。 据此可以认为,在寄主羽化并饥渴而死后尚未羽化的蛹绝大部分为寄生蜂蛹,满足风选分离的基本前提。 本试验也是首次采用风选机对果蝇锤角细蜂的蜂蛹和未被寄生的寄主羽化后留下的蛹壳进行分离。 结果表明,在蛹和蛹壳彼此不黏连的前提下,黑腹果蝇蛹壳和未羽化蛹风选的错分率可低于1%,其中未羽化蛹中掺杂的蛹壳比例更低。 这一比例明显小于果蝇锤角细蜂的羽化率标准误,几乎不会影响成蜂头数的估算。 因此,风选机可以用于大量生产中黑腹果蝇蛹壳和果蝇锤角细蜂蜂蛹的分离。

综上所述,本研究提出了以黑腹果蝇作为替代寄主大量饲养果蝇锤角细蜂的一套流程：(1)在收集大量新鲜蝇蛹后,以玉米淀粉法或滑石粉法分离彼此黏连的蛹；(2)利用自动数粒仪计数蝇蛹,根据最佳的寄生蜂与寄主比例投放供寄生；(3)在寄主羽化后,采用风选机分离蜂蛹和蛹壳；(4)用自动数粒计数蜂蛹,以便释放应用。 这套流程可为果蝇锤角细蜂的工厂化大规模饲养提供重要的理论基础。