冰川两种藓在超低温胁迫与恢复生长状态下叶肉细胞的超微结构

胡翠翠 路雄 王虹

摘 要： 為了探讨高寒冰缘区的藓类植物在超微水平的抗寒机制，该文对一号冰川下不同基质两种藓类植物水中土生的金黄银藓（Anomobryum auratum）和岩面土生的刺叶墙藓（Tortula desertorum）在常温、超低温胁迫和经胁迫后的恢复状态的超微结构进行对比。结果表明：室温下藓类植物叶肉细胞结构完整、清晰。-80 ℃超低温胁迫处理后叶肉细胞的超微结构的变化为两种藓类植物叶肉细胞大多数未出现质壁分离，但会出现质壁结构模糊，细胞质收缩;细胞器遭到破坏甚至解体的情况;淀粉粒、脂滴和液泡数量大大增加。在室温恢复过程中，线粒体数量增加，各个细胞器结构比超低温胁迫状态下完整性增加。根据该文的亚显微结构的分析推测这些变化是为了适应细胞迅速恢复生理功能，-80 ℃超低温胁迫没有完全使藓类植物丧失生理功能，还可以进行恢复。岩面土生刺叶蔷藓的叶细胞胞壁厚度为1 100～1 300 nm，大于水中土生金黄银藓的叶细胞胞壁厚度（200～700 nm），刺叶墙藓叶细胞胞壁比金黄银藓更厚，分析推断刺叶墙藓细胞器的抗胁迫能力也更强。综上结果表明：一号冰川的这两种藓类植物抗寒能力极强，它们独特的抗寒机制不仅与超微结构下植物淀粉粒、细胞器的结构和功能完整有关，还与其生境有关。

关键词： 冰川， 超低温胁迫， 恢复生长， 藓类， 超微结构

中图分类号： Q944

文献标识码： A

文章编号： 1000-3142（2020）11-1653-08

Abstract： To study Anomobryum auratum in native water and Tortula desertorum in rocky face of two species of mosses in different substrates under the No.1 glacier. Ultrastructural comparison of desertorum at room temperature under ultra-low temperature stress and recovery after stress. The mechanism of cold resistance of the mosses in the alpine ice margin was observed at the ultra-low level. After ultrasonic cleaning with ultrasonic analyzer， it was divided into -80 ℃ ultra-low temperature stress， room temperature recovery culture and normal temperature three groups， and ultra-thin sections were prepared by treatment with glutaraldehyde， phosphate buffer， citric acid， ethanol， acetone and other reagents. To observe and analyze the ultrastructure after dyeing. The results were as follows： The mesophyll of the mosses were intact and clear at room temperature. The ultrastructural changes of mesophyll cells under ultra-low temperature stress were as follows： Most of the mesophyll cells of the two mosses did not have plasmolysis， but the structure of the wall was blurred， the cytoplasm contracted; The organelles were destroyed or even disintegrated; The number of starch granules， lipid droplets and vacuoles were greatly increased. During the recovery at room temperature， the number of mitochondria increased， and each organelle structure was more complete than conditions of ultra-low temperature stress. According to the analysis of the ultrastructure in this paper， these changes are presumed to adapt to the rapid recovery of physiological functions of cells. The ultra-low temperature stress at -80 ℃ does not completely lose the physiological function of the mosses， and those functions can also be restored. The thickness of mesophyll cell wall in the natural silver carp was 1 100-1 300 nm. The thickness of mesophyll cell wall in the rocky spurs was 200-700 nm. The cell wall of the rocky spurs wall was thicker than the natural silver carp. It is inferred that the resistance to stress of the thorn wall organelle is also stronger. These two species of mites have strong cold resistance， and their unique cold-resistance mechanism is not only related to the structure and function of plant starch granules and organelles under ultrastructure， but also related to their habitat.

Key words： glacier， ultra-low temperature stress， restored growth， moss， ultrastructure

新疆天山一号冰川高寒冰缘区气候恶劣，寒冷多风，水分不易存留，其干旱指数是1.25，相对湿度为60%～70%，植被类群比较单一，属于永久性冰缘带边缘（安黎哲等，2000），而金黄银藓（Anomobryum auratum）和刺叶墙藓（Tortula desertorum）是这里典型的高山冻原植被带中的优势类群。相关科研人员之前对新疆一些旱生藓类植物及一号冰川地区的苔藓植物的结构做了解剖学研究（王虹等，2000， 2008， 2014， 2016， 2017a， b;曾健等，2015;陈秋艳和王虹，2016），指出在极端环境下生长的藓类植物结构特点，特别是同科、同属的相近而又有差异的形态特征，具有潜在的分类学及生态学意义。

一直以来，研究植物遭受逆境时的超微结构的变化多见于被子植物（Thomson & Moeller， 1983;颜季琼，1999）。何涛等（2005）对青藏高原东北部达坂山的5种高原植物叶绿体淀粉粒的超微结构进行研究，发现叶肉细胞叶绿体中都有大量的淀粉粒，高山植物叶绿体中淀粉粒的这种变化是对逆境的一种适应，是青藏高原特殊生态条件长期胁迫的结果。闻志彬等（2016）指出植物在轻度干旱胁迫时，细胞内的细胞器有轻微的损伤，重度胁迫时细胞中的叶绿体结构混乱、线粒体降解，而不同的组织间及同一组织间不同组织细胞的细胞器对干旱胁迫的反应是有差异的。研究表示在衰老、病变、严重胁迫下叶绿体的结构会出现不同程度的破坏（Wilttenbaeh et al.，1980;Cheeseman，1988;Crawford & Wildens，1996;Asada，1999）。近些年来对藓类植物进行逆境胁迫时超微结构的研究多为盐胁迫。刘卫国等（2016）研究了古尔班通古特沙漠中的优势种齿肋赤藓在不同浓度NaCl胁迫下的超微结构，观察到在低浓度时和未胁迫时没有明显的变化，在中浓度（200、300 mmol·L-1）时叶肉细胞开始发生质壁分离、大液泡破裂、叶绿体变形，出现脂质球，在高浓度（400、500 mmol·L-1）时质壁分离加剧、叶绿体片层结构消失、解体、叶肉细胞死亡，从而得出叶绿体膜结构的损伤与盐胁迫下叶肉细胞的死亡有密切的关系的结论。Wannson et al.（1976）对苔藓植物的脂质成分做了分析，在电镜下观察，其配子托呈现许多胞质中的锇积累物，甘油三酯含量高时胞质脂滴数量庞大，含量低的时候，其数量则少。Thomson & Moeller（1983）研究了酸雨对苔藓植物超微结构的影响等。魏美丽和张元明（2009）研究了生物结皮中齿肋赤藓叶片细胞显微与亚显微结构特征。Michele & Cauley（1992）研究了冰冻胁迫下葫芦藓的亚显微结构，如细胞膜的完整情况、基质的状态、细胞器的形态变化对植物的持水能力、抗旱能力等有重要意义。本文通过观察并比较一号冰川地区两种不同生境的藓类植物叶片的超微显微结构，探讨藓类植物的抗寒机制，以期为高寒地区植物抗旱御寒机制的研究提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

实验材料金黄银藓（Anomobryum auratum），水中土生，海拔3 553 m，凭证标本号：20160823017;刺叶墙藓（Tortula desertorum），岩面土生，海拔3 563 m，凭证标本号：20160823018，均于2016年8月采自新疆天山一号冰川东支退缩地的山前沼泽地，凭证标本存放在新疆大学生命科学与技术学院植物标本馆（XJU）。取绿色部分到干净的青霉素瓶，加入少许蒸馏水，等叶片舒展开来便抽气至沉在水中，并用超声波仪（型号：KQ-250DE）清洗两次。

1.2 方法

每种植物分别取60株以上的实验材料，用KQ-250DE型数控超声波清洗仪清洗后，先进行-80 ℃超低温胁迫24 h，再分出一半实验材料放在室温（20 ℃左右）进行恢复培养24 h。分别选取常温、超低温胁迫和恢复培养的植株中上部叶片放入EP管，用戊二醛溶液（3.00%的戊二醛，0.2 mol·L-1的Na2HP04，0.2 mo·L-1的NaH2P04，

pH7.4）固定，pH7.4的磷酸缓冲液冲洗，锇酸固定，磷酸缓冲液冲洗，乙醇脱水，丙酮系列置换，丙酮与包埋剂（Epon∶DDSA∶MNA∶DMP-30=13∶9∶7∶0.4）系列浸透，再用环氧树脂812包埋，然后放于温箱中聚合，在LEICA EM UC7切片机上进行超薄切片，厚度保持在110～120 nm之间，之后用醋酸铀和柠檬酸铅染色，在JEOI：1230透射电子显微镜下观察和照相。

2 亚显微结构分析

2.1 金黃银藓（Anomobryum auratum）

金黄银藓叶细胞在常温时，细胞质膜清晰，叶细胞胞壁厚度1 100～1 300 nm，相邻的细胞壁之间胞间连丝较弱，细胞内壁呈波浪状凹凸不均;细胞质收缩，细胞质中有稀少脂滴存在，叶绿体在细胞中央，圆形，较大，2个左右，有些叶绿体中有一些嗜锇颗粒或基粒，淀粉粒基本观察不到;基粒间膜系统较清晰，叶绿体基质片层多集中在中部、叠跺度很低;细胞核体积大仅次于叶绿体，核质均匀，有较小的核仁，但是色泽稍深;叶绿体和核附近有线粒体;细胞内液泡面积大，其中有一个形状不规则的大液泡，细胞质中还分散着许多的大小不一的小液泡（图版I：A， B）。

在-80 ℃的超低温胁迫下细胞膜不光滑界限不明显，但是未出现质壁分离现象;叶绿体不规则收缩，叶绿体内基质片层解体，转化成多个淀粉粒，形成碳水化合物储存形式，叶绿体其中留存基粒聚集成的质体球;观察的图片中未发现细胞核;其他的细胞器遭到了不同程度的破坏甚至解体，线粒体膜破坏，脊的形态模糊不清，甚至整个线粒体脊断裂，破损解体;中央大液泡缩减甚至消失，液泡壁界限模糊（图版I：C， D）。

3.2 叶绿体中的物质变化

在正常生长情况下这两种藓类植物叶片细胞的叶绿体中，质球体数量较多，但是在低温的胁迫下叶绿体结构受到很大程度的破坏，质球体数量急剧下降甚至消失，在恢复的状态下叶绿体的质球体数量又会上升。我们推测质球体与叶绿体的结构恢复有着密切的关联，可能质球体决定着叶绿体的数量。陈燕等（2003）的研究表明胁迫降低植物的光合磷酸化过程，从而使叶绿体基质片层叠跺度降低，继而加剧了膜结构的破坏。本研究中两种藓类植物在低温胁迫下的叶绿体基质片层的叠跺度都出现降低的情况。

另外，两种藓类植物叶片细胞中的叶绿体在被超低温胁迫之后的恢复阶段都有淀粉粒的出现，这与何涛等（2005）的研究是一致的，叶绿体白天进行光合作用产生淀粉供给线粒体使用或储藏在细胞中，一号冰川地区基本上长年都处在低温的情况下，此时植物的生理代谢较慢，有利于植物细胞中淀粉的积累。淀粉粒能让类囊体处于高糖环境而免于降解，同时在光照不足时，淀粉粒的水解释放能量也有助于抵御低温的环境（何若韫，1995）。周勇辉等（2016）也提出植物淀粉粒增大、增多，是适应低温、低气压、强辐射等多种逆境生态条件胁迫下的反应。我们推测这极可能是苔藓植物为适应寒冷极端环境的自我保护措施，但就本实验结果来看与植物生长的基质条件的关联性不大。

在低温胁迫下，两种藓类植物叶片细胞中都有类囊体膨大的现象，叶绿体叠跺度都较低，叶绿体的基质片层大部分解体，但有脂滴出现，岩面阴生的刺叶墙藓还有潴泡。类囊体膨大现象在杜军华等（2001）研究高山蚤辍和裸茎金腰叶时也有发现，虽然干旱、盐碱、强辐射等也会迫使植物叶绿体出现类囊体膨大现象，它可能还会引起叶绿体的解体，但那不是正常情况下的，不是长期的，正常的高寒地区的植物膨大的类囊体可以暂时保存来自呼吸作用的CO2和来自光合作用的O2，以保证植物能在CO2和O2稀薄的环境中正常生存。一号冰川地区的苔藓也是高海拔地区的高等植物，其叶绿体的类囊体膨大可能也是适应当地CO2和O2低分压环境的特征。吴学明（1997）的研究表明脂滴的出现与活性氧的清除有关，脂滴是低温和高辐射共同作用的结果，且为类囊体降解产物的聚集，周勇辉等（2016）的研究指出长期的低温使高原植物类囊体膨大、膜破裂甚至消失。一号冰川地区常年低温和高辐射等的极端环境下，两种藓类植物叶片细胞中都有类囊体和脂滴的发现，干旱胁迫和盐胁迫下植物也会出现脂滴以及类囊体肿大的现象（白志英等，2009;刘卫国等，2016），因此我们推测这是其适应生长环境的策略之一。

3.3 线粒体变化

线粒体是细胞的动力工厂，这两种藓类植物叶片在-80 ℃超低温胁迫后的恢复阶段，细胞中有大量的线粒体出现，这与陈燕等（2003）的研究结果一致，叶片受低温胁迫后线粒体的增多，可保证胁迫過程能量的供应，来支撑细胞的恢复过程的各个步骤，而叶绿体对超低温胁迫的敏感程度比线粒体更高，在胁迫条件下结构更容易破坏，这和万里强等（2009）的研究一致。

3.4 中央大液泡变化

中央大液泡是一个水溶性体系，是寒冷环境下最容易发生变化的细胞器，易受低温胁迫。本研究发现在超低温的胁迫下，原来细胞的中央大液泡会消失，取代它的是一些小的，弥散状的小液泡，小液泡的数量明显增多。推测这与细胞在寒冷环境下启动自我保护措施息息相关。液泡能通过吞噬、水解细胞质和其他细胞器，提高细胞液浓度，降低冰点，进而防止冰冻损伤（杨凤仙等，2001;陈旭微等，2005）

在新疆天山一号冰川地区生长的这两种藓类植物虽然生长基质不同，但在低温胁迫下又具有一些相同的细胞结构特点，如它们在超低温胁迫后没有或者出现轻微的质壁分离的现象，这是植物恢复生活能力的重要条件之一，因此其细胞可以恢复基本的生理功能。部分植物叶片又不同程度地受到了一些损害，细胞中的叶绿体不规则收缩，基质片层解体，线粒体等其他细胞器解体，中央液泡体积大大减小，转变成数量较多的小液泡，这与有些学者研究低温胁迫条件下植物的超微结构出现变化基本一致（杜军华等，2001;张静和朱为民，2012）。本研究发现这两种藓类植物在超低温胁迫后还能恢复生理功能，反映出藓类植物适应性极端恶劣环境的超强能力。在岩面土生的刺叶墙藓细胞壁（1 100～1 300 nm）比水中土生的金黄银藓（200～700 nm）厚一些，超低温胁迫时刺叶墙藓叶片细胞的内壁呈波状，通过对超微结构的图片观察比较结果推测细胞的恢复能力和各细胞器的抗胁迫能力来看刺叶墙藓也比金黄银藓稍强些，这是否与它们生长的条件有关还有待以后更系统的研究。

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（责任编辑 周翠鸣）