胶质芽孢杆菌SM-01 胞外多糖提取纯化工艺

郁 莉， 付海田， 彭梦霞， 邓 超， 陈敬华*

（1. 江南大学 工业生物技术重点实验室，江苏 无锡214122；2. 江南大学 药学院，江苏 无锡214122；3. 江南大学无锡医学院，江苏 无锡214122）

微生物胞外多糖是自然界中来源比较丰富的一类生物大分子，因其独特的理化性质和生物活性而被广泛的应用于食品和非食品工业以及医药领域[1]。 近年来，随着糖化学和糖生物学研究的深入，越来越多的新型微生物多糖相继被发现。 尽管如此，真正接近工业化生产的却仅有十几种，其中提取纯化工艺是微生物多糖工业化生产的制约因素之一[2]，微生物胞外多糖提取工艺直接影响多糖的质量以及生产成本。 因此，经济可行的提取工艺对提高多糖的市场竞争力和拓展多糖的应用领域具有现实意义。

胶质芽孢杆菌胞外多糖（BMPS）是胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）在微氮培养基中产生的一类类葡甘聚糖的酸性杂多糖[3]，因其具有良好的保水性、生物相容性、毒性低以及环境友好等优点，广泛应用于医药、化妆品、食品和环保等领域[4-6]，具有极大的开发价值和广阔的市场前景。 随着胶质芽孢杆菌胞外多糖在更多新领域的应用，其相关研究也越来越受到人们的关注。 目前，胶质芽胞杆菌胞外多糖的生产基本采用液体发酵工艺，其发酵液含有少量蛋白质且无色素产生， 但多糖含量较高，粘度较大，发酵液与菌体难以分离，给后续的分离纯化带来较大困难，从而导致产品收率低，生产成本高，对其推广应用极为不利。

作者所在实验室对B.mucilaginosusSM-01 发酵得到的发酵液进行预处理，利用稀释和加入NaCl的方法降低粘度，同时加入适当的硅藻土作为预吸附剂；在布氏漏斗中加入载片，预涂一定量的硅藻土作为自制的抽滤装置，采用抽滤的方法可以通过一步法去除菌体和杂蛋白质。 对得到的滤液采用超滤浓缩提取胞外多糖，建立了一条高效可行且经济的胞外多糖提取纯化工艺路线。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01：保藏于中国菌种保藏中心，保藏号5766。

1.1.2 培养基

1）斜面培养基（g/L）：葡萄糖10，尿素0.1，轻质CaCO33.0，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO40.2，NaCl 0.2，琼脂20；pH 7.0~7.2。

2）种子培养基（g/L）：葡萄糖10，尿素0.1，轻质CaCO33.0，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO40.2，NaCl 0.2；pH 7.0~7.2。

3）发酵培养基（g/L）：葡萄糖60，尿素0.3，轻质CaCO33.0，MgSO4·7H2O 0.6，K2HPO40.2，NaCl 0.4；pH 7.0~7.2。

1.2 仪器与设备

UV-2550 型分光光度计： 日本岛津公司；HeraeusMultifuge X3R 高速冷冻离心机： 美国Thermo 公司；THZ-C 型恒温振荡器：江苏太仓市实验设备厂；隔水式电热恒温培养箱：上海市跃进医疗器械一厂；硅藻土抽滤装置：自制；真空冷冻干燥机：美国Labconco 公司；磁力搅拌器：上海司乐仪器有限公司；SevenEasy 精 密pH 计： 上 海Mettler-ToLedo 公司；NDJ-1 型旋转粘度计： 上海恒平科学仪器有限公司；Labscale TFF System 小型切向超滤系统： 美国Millipore 公司；BiomaxPolythersulfone 小型超滤膜包 （膜面积50 cm2， 截留相对分子质量10 000、200 000、500 000）：美国Millipore 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 胶质芽孢杆菌胞外多糖的发酵将斜面保藏的菌种于平板上划线，30 ℃恒温培养24 h， 活化两次，将活化后的菌种接种到种子培养基中，30 ℃、150 r/min 培养24 h， 再将此种子液按4%的接种体积分数接入到30 L 的罐中，30 ℃、600 r/min、2 vvm发酵培养72 h 获得发酵液。

1.3.2 发酵液的预处理发酵液于80 ℃下搅拌加热20 min 进行菌体灭活， 同时加入6 mol/L 盐酸适量除去发酵液中残留的CaCO3， 由于发酵液中多糖含量较高而导致粘度较大，给后续的分离纯化带来一定困难， 降低发酵液的粘度有利于实现菌液分离。 通常对于含有聚电解质的发酵液可以通过添加盐、稀释体积、改变pH 值以及升高温度的方式降低粘度。

1）无机盐质量分数的选择：鉴于BMPS 为阴离子聚电解质，无机盐的加入对其分子链上的电荷具有屏蔽效应而使得分子链收缩，粘度降低。 考虑到培养基中无机盐含量较低，加入适当的无机盐将有效降低发酵液的粘度。 取等体积发酵液，分别加入质量分数1%~5%的NaCl，搅拌均匀后在25 ℃下测定其粘度。

2）稀释体积的选择：将发酵液加入不同体积去离子水稀释， 依次稀释到原体积的1、2、3、4、5 倍，分别测量稀释后发酵液粘度，将稀释后的发酵液进行离心和抽滤，比较离心和抽滤两种方法对去除菌体和蛋白质的影响。

3）pH 的选择：发酵液的pH 对其粘度也有一定的影响， 但是pH 过高或过低都会破坏多糖的分子结构， 因此将发酵液的pH 调节为1、3、5、7、9、11，分别测试不同pH 条件下发酵液的粘度。

4）硅藻土添加量的确定：在等体积发酵液中分别加入10、20、30 g/L 硅藻土，充分搅拌，在相同条件下抽滤，比较硅藻土添加量对去除菌体和蛋白质的影响以及对多糖回收率的影响。

1.3.3 超滤条件的确定通常对滤液中多糖的提取可以采用醇沉法，但对于较大体积滤液的醇沉易造成醇类的损耗，增加成本，且在醇沉过程中很多小分子物质如盐类也会随之沉淀出来。 膜超滤分离技术作为一种提纯和浓缩的技术， 具有设备简单、对样品无破坏、安全等优点，易于工业放大，该技术应用在多糖的制备中已有不少报道[7-9]。

1）超滤膜的选择：在25 ℃、0.1 MPa 条件下，采用三种超滤膜（10 000、200 000、500 000）对1 000 mL 滤液进行超滤浓缩， 考察膜通量随超滤时间的变化，比较不同超滤膜的多糖截留率。

2）操作压力的选择：在25 ℃下，采用200 000超滤膜对滤液在不同操作压力下（0.05、0.1、0.15 MPa）对1 000 mL 滤液进行超滤浓缩，考察不同操作压力下膜通量随时间的变化。

1.3.4 方法测定

1）发酵液粘度的测定：由于BMPS 发酵液粘度较高，因此选用4#转子进行粘度检测。 量取固定体积样品倒入100 mL 烧杯中，置于数显粘度计下，放入4#转子，旋转检测粘度。

2）菌体量测定：发酵液经去离子水稀释一定倍数后，660 nm 下测定吸光度。

3）多糖质量浓度测定：总糖质量浓度测定采用苯酚硫酸法[10]；还原糖质量浓度测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法[11]。

多糖质量浓度=总糖质量浓度-还原糖质量浓度

4）蛋白质质量浓度的测定：按照Bradford 方法[12]，牛血清白蛋白作为对照品。

5）多糖截留率计算：

式中，Vu指超滤浓缩体积；cu指超滤浓缩液中多糖浓度；Vi指料液体积；ci指料液中多糖浓度。

6）除菌率计算：

式中，Fa指初始发酵液中菌体量；Fb指处理后发酵液中菌体量。

7）除蛋白质率：

式中，Pa指初始发酵液中蛋白质质量浓度；Pb指处理后发酵液中蛋白质质量浓度。

8）多糖回收率：

式中，Ma指滤液中多糖质量浓度；Mb指初始发酵液中多糖质量浓度。

9）热原含量：热原的测定采用鲎试剂法[13]，脂多糖作为阳性对照。

10）紫外光谱：配制适宜浓度的多糖水溶液，进行紫外全波长扫描。

2 结果与讨论

2.1 发酵液预处理

2.1.1 无机盐、温度、pH 和稀释倍数对发酵液粘度的影响经过72 h 发酵得到白色粘稠初始发酵液，pH 约为6.5，多糖质量浓度较高（32.51 g/L），为提高菌体和发酵液的分离效果， 需要降低发酵液粘度。由图1 可以看出，NaCl 的添加量、 温度、pH 以及稀释倍数均对发酵液粘度有影响，其中稀释倍数对发酵液粘度的影响最为显著（图1（d）），随着稀释倍数的增大，粘度急剧下降，当稀释倍数为5 倍时，粘度由6.95 Pa·s 降低为0.16 Pa·s。 这是由于在初始发酵液中多糖质量浓度较高，分子链较长，多糖分子互相缠结导致粘度增大， 随着稀释倍数的增大，多糖链间距变大，分子缠结减小，粘度下降。 其次对发酵液粘度有较大影响的是NaCl 的添加量 （图1（a）），当发酵液中加入1%NaCl 时，发酵液粘度出现一定程度的降低；继续添加时，粘度变化逐渐减小；当添加量大于3%时，粘度基本不再变化，发酵液显示一定的抗盐性。 由图1（b）可以发现，温度对粘度的影响并不显著，当温度升至50 ℃时，发酵液粘度仅降低到4.9 Pa·s，虽然升温可以降低粘度，但是高温易造成分子链的断裂和构象的改变，通常提取纯化时应尽量避免高温条件。 图1（c）显示，酸性环境和碱性环境下发酵液粘度都有一定程度的降低，相比较酸性环境，碱性环境的粘度降幅更大，当pH 为11 时，粘度降为4.4 Pa·s。 考虑到过酸或过碱的环境都将造成多糖链上官能团的丢失以及多糖的降解，在纯化过程中应选择相对温和的pH 条件。

图1 不同因素对发酵液粘度的影响Fig. 1 Influence of different factors on the viscosity of the fermentation broth for B. mucilaginosus SM-01

可以发现， 通过升温和改变pH 的方式对发酵液的粘度影响均不大，且发酵液具有一定的耐盐性和耐酸碱性， 与黄原胶的耐酸碱和耐盐性比较相似，在黄原胶发酵液的预处理过程中，稀释法是常采用的降低粘度的方法。 考虑到向发酵液中添加NaCl 和稀释发酵液均能降低发酵液粘度且不会影响多糖的化学结构， 且过量NaCl 的添加对粘度影响不大，因此采用3 g/dLNaCl 添加量，稀释不同体积，考察不同稀释倍数下，离心和硅藻土过滤这两种方法对发酵液中除菌和除蛋白质的影响。

2.1.2 离心和抽滤对除菌率和蛋白质的影响在去除CaCO3的发酵液中加入3 g/dLNaCl，在不同的稀释倍数下分别考察离心和抽滤两种方式对发酵液除菌和除蛋白质的影响，结果见图2。当采用抽滤的方法时， 稀释倍数对除菌率的影响并不显著，除菌率在80%左右，这是由于硅藻土涂层能够有效截留以及吸附发酵液中的菌体， 即使稀释倍数较小时，通过抽滤可以除去发酵液中大部分菌体；与之相反，稀释对离心除菌效果影响比较明显，当发酵液不稀释或稀释倍数比较小时， 尽管有盐的存在，发酵液粘度依旧较大，菌体被多糖紧密包裹，除菌效果不理想，随着稀释倍数的增大，除菌率逐渐增大，当稀释倍数达到5 倍时，离心和抽滤的除菌效果比较接近。 稀释倍数对离心和抽滤的除蛋白质率影响皆不明显，随着稀释倍数的增大，除蛋白质率略微增大，但离心并不能有效除去发酵液中的蛋白质，除蛋白质率基本维持在6%左右；而对于预涂了硅藻土的抽滤装置来说，硅藻土涂层能较好的吸附蛋白质，达到除蛋白质的目的，除蛋白质率基本达到70%以上。 且离心的方法对设备的要求较高，较难实现工业化生产，因此利用吸附性过滤介质对发酵液进行除菌和除蛋白质是一个经济简便的方法。

尽管稀释倍数对离心和抽滤的除菌率和除蛋白质率影响皆不显著，但是其对抽滤通量和多糖回收率却有较大影响。 由表1 可知，当稀释倍数较小时，发酵液较为粘稠，在滤饼上容易形成凝胶层，因此，过滤通量较小，多糖回收率较低。 随着稀释倍数的增大，过滤通量和回收率逐渐增大，当稀释倍数高于3 倍时， 多糖回收率基本维持在恒定水平，约达90%。 然而过高的稀释倍数将会给后续浓缩带来麻烦，因此抽滤时采用3 倍体积稀释。

表1 稀释倍数对滤液的菌体量、抽滤通量及多糖回收率的影响Table 1 Influence ofdilution ratio on filtration of fermentation broth

2.1.3 发酵液中硅藻土的添加量对发酵液的影响硅藻土除了作为过滤介质， 还是一种理想的吸附剂，能够有效吸附菌体和杂蛋白质，且在发酵液中预先添加硅藻土还可以起到助滤剂的作用，抽滤效果更为理想，但过高的添加量通常会造成抽滤效率的下降和多糖的损失，因此应对硅藻土的添加量进行考察。 初始发酵液去除多余CaCO3， 加入3%NaCl，稀释3 倍后，再加入一定量的硅藻土，充分搅拌后再进行抽滤。 由表2 可知，无硅藻土添加时滤液中蛋白质质量浓度已经比较低（0.025 g/L），通过硅藻土抽滤基本可以去除发酵液中的少量蛋白质。当加入10 g/L 硅藻土后，滤液中菌体和蛋白质的质量浓度都有一定程度的降低，继续加入硅藻土对去除菌体和蛋白质并没有显著的影响，但是过量硅藻土则会同时吸附多糖，使滤液中多糖的质量浓度下降，多糖损失增加。 因此采用10 g/L 的硅藻土预吸附， 再进行抽滤可以有效除去大部分菌体和蛋白质，经过反复抽滤三次后，通过对滤液进行镜检可以发现无菌体存在， 说明菌体已经被完全去除，经检测蛋白质质量浓度接近零， 多糖回收率可达76.4%。

2.2 超滤条件的确定

经过抽滤所得发酵液仍含有无机盐，残糖以及一些可溶性的小分子， 且稀释造成发酵液体积过大，采用醇沉法易造成乙醇的损失，增加成本，因此采用超滤的方法代替醇沉法对滤液进行浓缩提取。

表2 硅藻土的用量对发酵液抽滤的影响Table 2 Influence of different concentrations of diatomite onfiltration

2.2.1 不同截留相对分子质量膜的膜通量比较在0.1 MPa、25 ℃下用不同截留相对分子质量的超滤膜对抽滤得到的滤液进行超滤浓缩，比较膜通量的差异，实验结果见图3。 由图3（a）可知，相同条件下，不同截留相对分子质量的膜对膜通量有较大的影响。 随着截留相对分子质量的增大，膜通量增大，膜通量达到稳定值的时间则越短，截留相对分子质量为500 000 的超滤膜在超滤20 min 后，膜通量迅速降低且趋于稳定， 这可能是由于500 000 截留相对分子质量的滤膜膜孔较大，发酵液中的多糖分子进入膜孔的几率较高，导致膜孔堵塞从而造成膜通量快速下降； 而对于截留相对分子质量为200 000和10 000 的超滤膜，由于膜孔小，大部分大分子被截留在外，膜堵塞的几率小，故膜通量下降缓慢。

图3 不同截留相对分子质量的膜对超滤的影响Fig. 3 Effect of membranes with different relative molecular weights cut-off on ultrafiltration

测定最终截留液中多糖质量浓度可以发现，截留相对分子质量为10 000 和200 000 超滤膜的多糖截留率接近，分别为96.4%和95.8%（图3（b）），而500 000 的则略有降低（82.2%），对前两者超滤后的滤液进行多糖质量浓度检测，发现质量浓度基本接近于0， 即10 000 和200 000 的超滤膜能将发酵液中多糖组分基本截留。 而500 000 超滤膜由于截留相对分子质量较大，损失部分多糖。 因此，选取200 000的超滤膜进行超滤。

2.2.2 超滤压力对膜通量的影响超滤压力增大可以提高膜通量，加快超滤速度，同时也会加速某些组分在膜孔的沉积， 造成膜孔较小甚至堵塞，使膜通量下降，能耗增大，故选择合适的超滤压力对超滤过程至关重要。 由图4 可以看出，压力越大，初始膜通量越大，随着超滤时间的延长，膜通量衰减的越快，当超过30 min 时，0.15 MPa 的膜通量接近0.1 MPa 的膜通量，相同的超滤时间内，0.05 MPa 膜通量衰减的最慢。 为了使超滤系统在较高的通量下运行且考虑到能耗和成本， 选取0.1 MPa 作为超滤压力较合适。 在此条件下对滤液进行超滤，直至滤液中糖质量浓度为零且电导率不再变化，最终多糖回收率可达73.2%。

图4 超滤压力对超滤通量的影响Fig. 4 Effect of pressure on ultrafiltration flux

2.3 胞外多糖理化性质

将浓缩液透析冻干得到胞外多糖，其性状为白色絮状固体，无臭无味，易溶于水，难溶于大部分有机溶剂。 其将多糖溶于纯水，经紫外扫描见图5。 仅在200 和230 nm 有吸收峰，在260 和280 nm 及附近没有吸收峰，表明多糖中几乎不含核酸和蛋白质等杂质。 同时对多糖进行热源检查，发现其内毒素含量低于标准限度0.25 EU/mL。

图5 多糖水溶液的紫外扫描Fig. 5 UV spectrum of exopolysaccharide in pure water

3 结 语

胶质芽孢杆菌胞外多糖发酵液粘度较大，菌液分离困难，通过考察NaCl 的添加量、pH、温度、稀释倍数对发酵液粘度的影响， 发现将发酵液加入3%的NaCl 后稀释3 倍可以有效降低发酵液粘度，通过在发酵液中加入10 g/L 的硅藻土作为预吸附剂，采用硅藻土吸附-抽滤的预处理方式代替离心能够有效去除菌体和杂蛋白质， 经过反复抽滤3 次后，经镜检无菌体存在， 蛋白质质量浓度接近于零，多糖回收率达76.4%。选用截留相对分子质量为200 000的中空纤维膜在0.1 MPa 的操作压力下进行超滤浓缩，基本能够截留所有多糖组分，通过不断浓缩除盐得到最终产品，胞外多糖总回收率达73.2%，样品中内毒素含量低于0.25 EU/mL。 因此通过硅藻土预吸附-抽滤方式可以一步除去发酵液中的菌体和蛋白质，同时通过超滤浓缩的方法代替醇沉提取胞外多糖，极大地节约了成本，此方法简便经济，且适合工业化生产。