不同杂交瘤细胞株单链抗体的构建及性质比较

胡 莉， 刘爱平， 王小红

（1. 黄淮学院 生物与食品工程学院，河南 驻马店463000；2. 四川农业大学 食品学院，四川 雅安625014；3. 华中农业大学 食品科技学院，湖北 武汉430070）

黄曲霉毒素B1（AFB1）主要是由产毒黄曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉产生的具有极高毒性的次生代谢产物。 AFB1 可以在农作物生长、收获、贮藏、运输和销售等任何环节中产生，并由此直接进入食物链，造成淀粉类食品、动物性食品与肉、蛋、奶等的交叉污染。 AFB1 对人和动物的肝脏具有很强的毒性，是国际公认的致癌物质[1]。 因此，AFB1 的检测与分析技术的研究是非常必要的。 到目前为止，关于AFB1 分析检测方法的研究报道很多， 如薄层层析法、高效液相色谱法、纳米金标记法、免疫亲和柱法和近红外光谱法[2-5]。 免疫化学学分析法因具有快速、简单、灵敏、针对性强等优点而被广泛应用，在这些检测方法中，其中ELISA 法要求有较高质量的抗体[6-13]。

在过去的十年里，在抗黄曲霉毒素多克隆抗体的基础上，对半抗原具有不同亲和力的抗黄曲霉毒素单克隆抗体应运而生。 在免疫检测方法中，抗原和抗体之间的高亲和力是非常重要的。 随着抗体技术的发展，重组抗体尤其是单链抗体（ScFv）已经运用到黄曲霉毒素的检测中[14]。重组抗体具有成本低、易于操作的亲和力和灵敏度的特点。 而且，通过定点突变的方法可以提高抗体亲和力。

单链抗体（single chain Fv antibody fragmment，ScFv）是由抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL） 通过一段约45~75 个碱基组成的柔性肽（Linker）连接而得到的[15-17]，是一种新型重组小分子抗体蛋白质。 scFv 仅为完整抗体的1/6 大小，由于其相对分子质量小，结构单位小，因此其组织穿透力强，免疫原低，可在多种表达系统中表达，具有成本低，血流中半衰期短等特点，在医学和生物学领域中的应用极为广泛[18-21]。又由于scFv 易于制备、无Fc 段引起的非特异性反应、易于改造且表达产量高而获得了研究学者们的广泛关注。 scFv 中的VH 和VL 来源于不同的杂交瘤细胞， 构建成的scFv 的灵敏度、特异性等生物活性也有所不同。

作者所在实验室通过大量筛选，最后得到几株能稳定分泌抗黄曲霉毒素单克隆抗体的三株杂交瘤细胞株（2C10、2E6 和2H1），在这些细胞中，2C10杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体表现有最高的灵敏度，2E6 次之，2H1 再次之。 分别提取杂交瘤细胞的总RNA，设计通用引物，采用分子生物学技术分别克隆其相应的重链可变区 （heavy chain variable region，VH） 和 轻 链 可 变 区 （light chain variable region，VL）基因，以一段连接肽（Linker）将VH 和VL 连接起来，组装成三种不同的scFv 基因。将通过融合PCR 构建的scFvs 在大肠杆菌表达系统中进行蛋白质表达，纯化蛋白质后通过竞争ELISA 法展现不同的单克隆抗体与所对应的单链抗体灵敏度之间的关系；另外分别对编码单链抗体的3 种可变区基因（VH/VL）进行克隆和测序，并对此做核酸同源性分析和氨基酸同源性分析。 通过可变区基因序列的比对， 比较VH 和VL 来源的不同对scFv 生物活性的影响，初步探究具有高灵敏度蛋白质的碱基结构组成， 以便后续改善和提高重组抗体的灵敏度，并获得更高灵敏度的重组抗体。

1 材料与方法

1.1 实验材料

AFB1： 购于瑞士Alexis 公司； 杂交瘤细胞株2C10、2E6、2H1 和E.coli菌株Trans5α、表达菌株E.coliBL21（DE3）及表达载体pET-30a：为作者所在实验室常规保存；Easy Taq 酶、 Trans2K Plus DNA Marker、Trans5K Plus DNA Marker：购于中国北京全式金生物技术有限公司； 限制性内切酶、DNA 连接酶、PMD19-T Simple Vector： 购自TaKaRa 公司；质粒小提、DNA 凝胶回收试剂盒： 购自杭州AxyGen；引物：南京金斯瑞生物科技有限公司合成；羊抗小鼠IgG-HRP 酶标二抗： 购于中国华美生物工程公司；质粒提取试剂盒：购于中国北京擎科新业生物技术有限公司；Ni-NTA 亲和层析填料、ECL 显色液、Page RulerPrestained Protein Ladder： 购于美国Thermo 公司；DNA 凝胶回收纯化试剂盒：购于中国北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计与目的基因扩增活化并亚克隆实验室筛选保存的灵敏度分别为 9.54、85.76、203.00 ng/mL[22]的 三 株 杂 交 瘤 细 胞 株2C10、2E6 和2H1， 收集8×106杂交瘤细胞， 采用TRIzol 试剂（Invitrogen，USA） 分 别 进 行 总RNA 的 提 取。 以oligo-dT18 为引物，经反转录PCR（RT-PCR）获得三种不同的单链cDNA。 RT-PCR 反应体系为25 μL：5 μL 的5×primescript buffer，1 μL 的50 mmol/L oligo-dT18，2 μL 的2.5 mmol/L dNTP 溶液，0.5 μL的RNase inhibitor，5 μL 的总RNA，以及0.5 μL 的primescript RTase（200 U/μL），11 μL 的DEPC 处理过的ddH2O。RT-PCR 反应程序为：25 ℃10 min，42℃1 h，70 ℃15 min。

分别以已经获得的cDNA 为模板， 以VHFOR、VH-Back、VL-FOR 和VL-Back 为引物[23-24]，PCR 扩增VH 和VL 基因，见表1。 将获得的VH 和VL 基因片段分别连接到载体pMD19-T 上，将获得的重组载体pMD19-T-VH 和pMD19-T-VL 转化到E. coliTrans5a 细胞中，以便基因测序。

以已经测序成功的重组质粒pMD19-T-VH-2C10/2E6/2H1 和pMD19-T-VL-2C10/2E6/2H1 分别为模板， 设计相应的引物， 采用重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR）扩增scFv-2C10/2E6/2H1 基因片段[25]，并在目的基因两端分别引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点。

首先，以引物1 和引物2 为引物，PCR 扩增出3种带有部分Linker 的VH-Linker 片段；以引物3 和引物4 为引物，PCR 扩增出3 种带有部分Linker 的Linker-VL 片段。 PCR 扩增条件如下：95 ℃预变性5 min，（94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），28 个循环，72 ℃延伸8 min。每轮PCR 后，将3 μL PCR 产物与1 μL 6 × Loading buffer 混匀，采用0.8 g/dL 的琼脂糖凝胶电泳分析并借助凝胶回收试剂盒分别纯化回收不同的PCR 产物VHLinker 和Linker-VL。 然后， 通过SOE-PCR 构建scFv-2C10/2E6/2H1 基因。 SOE-PCR 分两步：第一步， 以上述回收的产物VH-Linker 和Linker-VL 为模板进行PCR 扩增反应，将VH 和VL 通过Linker连接合成一条单链。 PCR 扩增条件如下：95 ℃预变性5 min；（94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），10 个循环；72 ℃延伸8 min。经0.8 g/dL 的琼脂糖凝胶电泳分析并纯化回收PCR 产物。 第二步， 以第一步纯化产物为模板， 以引物1 和引物4为引物， 分别PCR 扩增scFv-2C10/2E6/2H1 基因。PCR 扩增条件如下：95 ℃预变性5 min；（94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min），30 个循环；72 ℃延伸10 min。 经0.8 g/dL 的琼脂糖凝胶电泳分析并分别纯化回收PCR 产物。 根据基因来源的不同， 最后获得3 种不同的PCR 产物， 即为NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2C10、NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2E6 和NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2H1。

表1 VH、VL 和scFv 基因PCR 扩增、克隆所用的引物序列Table 1 Nucleotide sequences and primers used for VH,VL and scFv amplification, cloning, and subcloning

1.2.2 重组质粒pET-30a-pelB-scFv-2C10/2E6/2H1 的构建和鉴定PelB 信号肽可以引导蛋白质产物在细胞周质表达，为了方便后续的蛋白质纯化工作， 现将pET-22b 载体上的pelB 信号肽序列克隆到最终使用载体pET-30a 上，方法分为两步。 首先将 “1.2.1” 中第二步获得的PCR 产物NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2C10、NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2E6、NcoⅠ-scFv-XhoⅠ-2H1 和质粒pET-22b 均采用限制性内切核酸酶NcoⅠ和XhoⅠ进行双酶切， 纯化回收产物后，采用DNA 连接酶将scFv-2C10/2E6/2H1 和pET-22b 进行连接获得重组质粒pET-22b-scFv-2C10/2E6/2H1，并转化E. coliTrans5α 细胞。挑取单克隆进行菌落PCR 验证。

然后提取上述阳性克隆子pET-22b-scFv-2C10/2E6/2H1 的质粒， 纯化后将重组质粒pET-22b-scFv-2C10/2E6/2H1 和质粒pET-30a 分别用NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切，纯化回收产物后，采用DNA 连接酶将pelB-scFv-2C10 和pET-30a 进行连接， 获得重组质粒pET-30a-pelB-scFv-2C10/2E6/2H1 并转化E. coliTrans5α 细胞。 挑取单克隆进行菌落PCR 验证，选取阳性转化子送至南京金思瑞生物科技有限公司测序。

测序正确的阳性转化子培养并提取质粒后，将空载体pET-30a 和所提取质粒分别转化到BL21（DE3）感受态细胞中，挑取菌落转化子进行PCR 验证， 阳性转化子分别命名为BL21 （DE3）-pET-30a和BL21（DE3）-pET-30a-pelB-scFv-2C10/2E6/2H1。

1.2.3 重组质粒pET-30a-pelB-scFv 的表达及鉴定无菌条件下挑取1.2.2 中转化成功的单菌落转化子BL21 （DE3）-pET-30a 和BL21 （DE3）- pET-30apelB-scFv-2C10/2E6/2H1，分别培养于100 mL 液体LB 培养基中（含有100 μL 的50 mg/mL 的kana），于200 r/min、37 ℃条件下培养至OD600nm为0.8 左右时， 加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），并使其终浓度为1 mmol/L，16 ℃诱导表达20 h。多次试验发现，诱导时间为20 h 时蛋白质表达量达到最高。 收集菌体，进行蛋白质预表达分析实验。

由于pelB 信号肽的存在， 所以基本确定目的蛋白质主要存在于细胞周质内。 又由于只有当新生肽链的合成速率大于蛋白质折叠速率时，蛋白质才会以包涵体的形式存在，而肽链的合成速率又与温度有着直接的关系， 选择16 ℃低温诱导蛋白质的表达可以有效地避免包涵体形式的形成，且实验证明的确如此。

采用SDS-PAGE 对scFv-2C10/2E6/2H1 的预表达情况进行验证分析， 将破碎后的菌体细胞于4℃低温离心， 可溶性蛋白质经镍柱亲和层析法进行蛋白质纯化，纯化后的蛋白质与上样缓冲液混匀后煮沸6 min 直接上样，经SDS-PAGE 验证后，接着转印PVDF 膜，再以5%牛奶封阻PVDF 膜，最后采用羊抗小鼠IgG-HRP 酶标二抗孵育后， 利用ECL显色液显色，观察结果。

1.2.4 抗AFB1 scFvs-2C10/2E6/2H1 的性质分析以20 mL PBS 缓冲溶液悬浮，在冰浴条件下将细胞超声破碎（30 min，功率105 W，2 s 开启，2 s 关闭），4 ℃下10 000 r/min 离心10 min，取上清液，采用镍柱亲和层析纯化上清液，纯化后所得到的蛋白质经SDS-PAGE 初步验证后，再以间接竞争ELISA 检测上述两种表达载体所表达的目的蛋白质抗AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1 的灵敏度， 试验中以pET-30a空载体的表达为阴性对照。

用CBS 缓冲液稀释AFB1O-OVA 为1 μg/mL，包被96 孔板过夜，PBST 洗涤甩干。 每孔加入200 μL 封阻液，37 ℃静置2 h， 甩干封阻液，PBST 洗涤甩干。 每孔加入90 μL 用PBST 稀释的抗AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1 和10 μL 以PBS 稀释的不同质量浓度的AFB1 溶液（质量浓度分别为2、8、20、40、60 μg/mL），37 ℃静置1 h， 甩干液体，PBST 洗涤甩干。 每孔加入100 μL 的羊抗鼠IgG-HRP 酶标二抗（以PBST 4 000 倍稀释），37 ℃静置1 h，甩干液体，PBST 洗涤甩干。 每孔加底物缓冲液100 μL，37 ℃静置15 min， 每孔加入50 μL、2 mol/L H2SO4终止反应，492 nm 测吸光值。

2 结果与分析

2.1 目的基因scFv-2C10/2E6/2H1 扩增

以 质 粒 pMD19 -T -VH -2C10/2E6/2H1 和pMD19-T-VL-2C10/2E6/2H1 分别为模板，经SOEPCR 第一步扩增产物为模板， 进行第二步PCR，获得两端带有酶切位点的产物scFv-2C10/2E6/2H1 基因。 经0.8 g/dL 琼脂糖凝胶电泳检测， 大小约为750 bp， 与理论值一致， 见图1。 回收试剂盒回收scFv-2C10/2E6/2H1 基因片段。

2.2 株间氨基酸序列同源性比较

由于三种VH 氨基酸和VL 氨基酸均来自于杂交瘤细胞， 且单克隆抗体的灵敏度高低顺序为2C10＞2E6＞2H1， 因此使用NCBI Blast 分析比对各株间VH、VL 氨基酸序列的同源性， 比对分析结果分别见表2～3。

图1 scFv-2C10/2E6/2H1 基因的PCR 扩增结果Fig. 1 PCR results of amplification scFv-2C10/2E6/2H1

表2 不同VH 氨基酸序列比较分析Table 2 Homology analysis of different VH amino acid sequence

表3 不同VL 氨基酸序列比较分析Table 3 Homology analysis of different VL amino acid sequence

由表2~3 可知， 菌株2C10 和2E6 之间的重链可变区氨基酸序列的同源性是100%， 与2H1 的同源性只有42.74%；2H1 和2C10、2E6 和2C10 之间的轻链可变区氨基酸序列的同源性分别为42%和43%， 而2E6 和2H1 之间的同源性可以达到59%。相同的重链，不同的轻链对单链抗体的生物活性也有一定的影响。

2.3 重组质粒pET-30a-pelB-scFv 的构建及鉴定将pET-30a 质粒和回收产物pelB-scFv-2C10/

2E6/2H1 分别进行NdeⅠ和XhoⅠ双酶切反应和连接反应，获得重组质粒pET-30a-pelB-scFv。 将重组质粒转化到E.coliTrans5α 细胞，挑取转化子，以引物1 和引物4 对其进行菌落PCR 验证，见图2（a）。PCR 产物大小约为750 bp，与理论预期值一致。 测序结果进一步验证了重组质粒构的建成功。

将测序成功的阳性转化子pET-30a-pelB-scFv和空质粒pET-30a 分别转化到BL21（DE3）感受态细胞中，转化子进行PCR 验证，见图2（b），PCR 产物大小约为750 bp，与理论值一致。

图2 含目的基因的转化子PCR 验证结果Fig. 2 PCR results of transformants containing target gene

2.4 重组质粒pET-30a-pelB-scFv 的表达及鉴定

挑取固体LB 平板上生长的阳性菌落进行诱导表达， 镍柱亲和法纯化表达蛋白质， 采用SDSPAGE 和Western blot 对 抗AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1 蛋白质进行验证， 结果见图3。 由图3 可知，SDS-PAGE 和Western blot 鉴定结果表明已成功诱导表达了目的蛋白质，该蛋白质相对分子质量约为29 000，与目的蛋白质理论值一致。 BCA 法测定诱导20 h 纯化后目的蛋白质的产率约为34 mg/L。

2.5 抗AFB1scFv-2C10/2E6/2H1 的性质分析

分别以间接非竞争ELISA 和间接竞争ELISA纯化后的scFv-2C10/2E6/2H1 进行分析。 间接非竞争ELISA 表明，AFB1O-OVA 包被质量浓度为1 μg/mL，抗AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1 的质量浓度约为0.17 mg/mL 时，OD492nm约为1.0。 在此条件下，以AFB1 为竞争抗原， 进行间接竞争ELISA 检测不同表达系统表达的目的蛋白质的灵敏度，并取五点以绘制scFv-2C10/2E6/2H1 的间接竞争抑制曲线，由图4 可知， 目的蛋白质scFv-2C10/2E6/2H1 的检测灵敏度分别约为40、50 μg/mL 和大于50 μg/mL。可以看出，随着单克隆抗体灵敏度的下降，它所对应的单链抗体的灵敏度也随之降低。这表明scFv 的灵敏度与其本身的VH 和VL 的基因组成相关， 要想改变scFv 的灵敏度，可以考虑改变其基因组成。

图3 抗AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1 表达的SDS-PAGE 和Western-blot 分析Fig. 3 SDS -PAGE and Western -blot analysis for expression of anti-AFB1 scFv-2C10/2E6/2H1

图4 scFv-2C10/2E6/2H1 的间接竞争ELISA 抑制曲线Fig. 4 IC-ELISA inhibition curves of pET-30a-pelBscFv-2C10/2E6/2H1

3 结 语

基于AFB1 的毒性，其检测极限显得尤为重要。目前的检测分析方法中使用较广的是酶联免疫吸附法，该法以检测快速、灵敏、样品制备简单等优点而广受关注。 在该检测方法中，抗体是核心试剂，以实验室保存的抗AFB1 单克隆杂交瘤细胞株为原料构建不同的scFv 基因。

目前，对于外源蛋白质的表达，E. coli表达系统是应用较多、 研究较多的， 也最具有代表性的，E.coli作为AFB1scFv 的表达系统，E. coli具有操作方便快速、实验周期不长、生产成本小等优点。

pelB 信号肽可以引导目的蛋白质在细胞周质内表达，并且采取一定的手段可以避免包涵体的形成，增加可溶蛋白质的表达，提高纯化效率[26]。 基于此，实验先将目的基因克隆到带有pelB 信号肽的载体pET-22b 上， 再将pET-22b 上的pelB 信号肽序列和目的基因序列一同克隆到载体pET-30a 上，这样是为了充分利用pelB 信号肽的上述特性。 基于此，实验将三种目的基因分别转化E. coli表达体系进行蛋白质表达。 最终本研究成功构建了三种重组载体pET-30a-pelB-scFv-2C10/2E6/2H1，并将其转化到相应的表达细胞中进行蛋白质表达， 以分析scFv 的亲和力是否与其对应的单克隆抗体有关。 实验结果显示， 蛋白质最高表达量约为34 mg/L。 经ELISA 实验结果表明， 三种目的蛋白质scFv-2C10/2E6/2H1 均显示出活性， 检测灵敏度分别约为40、50 μg/mL 和大于50 μg/mL。 这说明随着单克隆抗体灵敏度的升高，其所对应的单链抗体的灵敏度也随之升高，原因可能是scFv 的灵敏度与其碱基组成息息相关。其次，由于2C10 和2E6 的重链可变区的碱基组成是相同的，而二者的灵敏度却有一定的差距，这充分说明单链抗体与抗原的结合位点不仅存在于重链，轻链的影响也很大。 所以，接下来的实验要想调高其灵敏度， 还需要大量的实验分析和改进，分析其原因最终可能是因为scFv 的自身编码基因的亲和力不够高，所以在未来的实验中，可能会采取基因工程技术手段，如基因定点突变或随机突变等对scFv 的亲和力进行提高。