地黄RgCDPK基因的克隆与表达分析

原增艳 宋小锋 朱畇昊

摘 要：钙依赖型蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases， CDPKs）是高等植物细胞中重要的钙离子信号受体，在植物抵御逆境胁迫过程中发挥着重要作用。该研究以地黄为材料，设计特异引物，克隆地黄RgCDPK基因全长序列，并使用在线软件进行生物信息学分析，采用荧光定量PCR技术进行组织特异性分析。结果表明：（1）克隆得到的地黄CDPK基因长度为1 770 bp，编码589个氨基酸;（2）多序列比对和结构分析显示，该蛋白含有钙依赖蛋白激酶典型结构域丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区及EF-手性区。系统进化分析表明其与拟南芥 AtCDPK28 的同源关系最近，因此命名为RgCDPK（Genbank登录号为MT024235）;（3）组织特异性分析得出RgCDPK在地黄叶中表达量最高。该研究成功克隆出地黄CDPK基因，且发现该基因在不同组织中的表达存在差异，为以后深入研究CDPK在地黄连作障碍等生物及非生物胁迫中的分子机制提供理论基础。

关键词：地黄， 钙依赖蛋白激酶， 生物信息学， 组织特异性

中图分类号：Q943.2

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2020）12-1816-08

Abstract：Calcium-dependent protein kinases （CDPKs） are important calcium sensors in higher plants， which play an important role in plant resistance to envirenment stress.In this study， a full-length cDNA of RgCDPK gene was cloned from Rehmannia glutinosa.Meanwhile， the bioinformatics analysis was used the online software， quantitative real-time PCR technique was used to detect RgCDPK expression level in different tissues.The results were as follows：（1）The full-length cDNA sequence of RgCDPK gene was 1 770 bp and encoded 589 amino acid residues; （2） Multiple sequence alignments and structural analysis revealed that its protein contained serine/threonine protein kinase region and EF-hand region， which were typical domains of calcium-dependent protein kinase.Phylogenetic analysis showed the highest similarity with Arabidopsis AtCDPK28.Thus， the gene was defined as RgCDPK （Genbank accession No.MT024235）; （3）The expression analysis of RgCDPK in different tissues revealed that high transcript levels occurred at leaves.In this study， the CDPK gene of R.glutinosa was successfully cloned， and the expression of the gene in different tissues was found to be different.The results of this study provide theoretical basis for further study on the function of CDPK in biotic， abiotic stresses and continuous cropping obstacles.

Key words：Rehmannia glutinosa， calcium-dependent protein kinase， bioinformatics， tissue specificity

Ca2+ 是植物細胞中重要的第二信使，当一些刺激信号使胞内Ca2+浓度增加至阈值时，产生信号并传递。钙依赖型蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases， CDPKs）是一种普遍存在的蛋白激酶，当CDPK与Ca2+结合后，CDPK被活化发挥作用（Guo et al.， 2019）。CDPK在植物响应高温、干旱、紫外线等非生物胁迫和内生菌、虫害等生物胁迫中起重要作用，同时，CDPK也在植物的生长与发育、胞内激素调节等方面都发挥重要作用（Romeis et al.，2000; Geiger et al.，2010）。CDPK基因具有4 个典型的结构域，依次分别为N 末端的可变区、催化区、自抑制区和调控区。调控区一般含有多个Ca2+ 结合的EF 手型结构（EF-hand）。Ca2+与EF-hand结合后， CDPK空间结构发生变化，导致自抑制区的抑制作用解除，促使CDPK 恢复其蛋白激酶活性，进而磷酸化下游调控因子，将信号传递至下游调控网络，从而完成对信号的响应（Hetherington et al.，1982; Harmon et al.，1987）。CDPK在植物根、茎、叶、花、果实和种子等组织中广泛分布。通过基因组数据分析发现，拟南芥、水稻、玉米基因组中分别有34、31和40个CDPK基因（武志刚等，2018）。多种药用植物如铁皮石斛（盛况等，2017）、天山雪莲（田晓涵等，2016）和龙血树（张浩等，2010）中的CDPK基因也已被克隆，但地黄CDPK基因克隆的研究还未见报道。

地黄为玄参科植物地黄属植物地黄（Rehmannia glutinosa）的新鲜或干燥块根，具有清热生津、凉血止血、滋阴补血等功效（李慧芬，2014）。地黄栽培历史悠久，历代名医对优质地黄产地的认识几经变迁，自明朝以来，即确立了怀庆地黄的道地地位。怀地黄具有悠久的药用历史，用药需求不断增加，但是在栽培生产上，地黄具有严重的连作障碍，每茬收获后需要8～10 a后才能复种（刘红彦等，2006）。张重义等（2013）研究发现，地黄可能依赖钙离子信号系统传递自毒物质信号，导致连作危害，其中CDPK家族基因在其中也发挥了重要作用。杨楚韵等（2017）在地黄中鉴定出了21个可能参与连作地黄钙信号感知、传导和响应连作胁迫进程的CDPK家族基因，但并未对其进行克隆及表达分析。本课题组前期进行了地黄组培苗的转录组测序及分析，从中查找到1 条新的编码钙依赖性蛋白激酶的基因，并通过比对发现该基因序列完整。本研究分析了该基因编码蛋白的理化特性、结构特征和亚细胞定位，检测了其在不同组织中的表达特性，以期为深入研究其在地黄连作障碍等生物及非生物胁迫中的分子机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

材料取自河南中医药大学植物园，经朱畇昊副教授鉴定为玄参科地黄（Rehmannia glutinosa）。所用地黄品种为“沁怀”，在6月份地黄开花时，挖取地黄植株整株，洗净后分别取根、叶、花组织，用锡纸包好，液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱保存，以备后续使用。

1.2 RNA的提取及cDNA 的合成

取新鲜地黄叶片、根、花瓣各0.1 g，在液氮中速冻，用TRIzol 试剂（Thermo Fisher Scientific）提取RNA。RNA使用1%琼脂糖电泳凝胶检测纯度，检测合格后用于后续cDNA的合成。取7 μL RNA 使用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]合成cDNA，具体操作方法参照试剂盒说明书进行。

1.3 地黄CDPK基因的克隆

以地黄组培苗转录组数据库中一条注释为CDPK的unigene全长序列为参考序列，使用Primer Premier 5设计特异性引物，具体见表1。PCR 反应体系为20 μL，具体组分如下：模板cDNA 2.0 μL、2×Es Taq mix 10 μL、上下游引物（RgCDPK-F，RgCDPK-R）各1.0 μL、其余用ddH2O 补足。反应程序设计如下：95 ℃，3 min;95 ℃，45s，58 ℃，45 s，72 ℃，2 min，35个循环;72 ℃延伸 10 min。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化回收得到目的片段，使用pMD19-T 载体进行目的片段的连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化后产物于含氨苄青霉素的LB固体培养基上37 ℃培养过夜后筛选白斑，菌液经PCR 验证后送至生工生物工程股份有限公司测序。

1.4 地黄CDPK基因的生物信息学分析

使用ORF Finder（http：//www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html） 进行开放阅读框查找;使用BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列的同源性搜索;使用Protparam （http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html） 预测蛋白的分子量等理化性质;使用在线软件SinalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預测分析蛋白信号肽;使用TMpred（https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html）预测蛋白跨膜区;使用NPSA server（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopm.html）预测蛋白二级结构;使用PSORT（https：//www.psort.org/）预测蛋白亚细胞定位;使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）预测蛋白功能域;使用NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在线软件预测蛋白磷酸化位点;使用MEGA6.0构建系统和进化树;使用DNAMAN进行多序列比对。

1.5 荧光定量PCR

根据荧光定量引物设计方法，用Primer 5.0设计引物qRgCDPK-F、qRgCDPK-R，以TiP41为内参基因。参照荧光定量PCR试剂盒的步骤，配成20 μL的体系：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、引物各0.4 μL、QN Rox Reference Dye 0.1 μL、ddH2O 7.1 μL、模板cDNA 2 μL。 PCR反应程序如下：预变性95 ℃ 20 s，变性95 ℃ 1 s，退火56 ℃ 20 s，延伸95 ℃ 1 s，40个循环;60 ℃ 20 s，95 ℃ 1 s进行扩增。反应结束后，根据得到的Ct 值，利用2-ΔΔCt，分别计算不同组织的表达量。

2 结果与分析

2.1 RgCDPK基因的克隆

提取后的RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测可见三条清晰条带，条带无降解及杂带，说明RNA质量较高，无降解，可用于后续实验。如图1所示，特异性条带长度约为1 800 bp。将PCR产物克隆到pMD19-T载体后挑选阳性克隆双向测序。测序结果拼接后经ORF Finder 预测，该序列含有一个大小为1 770 bp的完整的开放阅读框，编码589个氨基酸。测序结果使用DNAMAN软件与转录组序列进行多序列比对发现，克隆所得序列与转录组所得序列完全一致。通过BLAST 程序检索，该片段与紫花风铃木（Handroanthus impetiginosus，PIN08903.1）、猴面花（Erythranthe guttata，XP_012857661）、旋蒴苣苔（Dorcoceras hygrometricum，KZV40794.1）CDPK 蛋白序列的同源性分别为89%、86%、82%。

采用 InterProScan 在线预测工具对地黄RgCDPK蛋白的保守结构域进行分析，RgCDPK具有5个保守结构域，分别是在126～386位的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域和4个EF-hand，钙离子结合结构域（433～461，470～498，512～540，542～570）由此确定该序列为地黄CDPK基因的cDNA 全长序列，将其命名为RgCDPK，将其序列提交至GenBank，获得登录号为MT024235。

2.2 RgCDPK的生物信息学分析

2.2.1 RgCDPK蛋白质理化性质及疏水性分析 RgCDPK基因的开放阅读框大小为1 770 bp，共编码589个氨基酸残基。RgCDPK蛋白质的相对分子质量为66.06 kD;理论等电点（PI）为5.91，原子组成C2908H4624N832O890S18，总原子数为9 272，带负电的氨基酸有80个（Asp + Glu），带正电的氨基酸有89个（Arg + Lys）。蛋白质稳定性分析发现CsCDPK17 的脂肪指数为73.06，不稳定系数为45，推测其为不稳定蛋白质。总平均亲水系数为-0.584，属于亲水性蛋白。

2.2.2 RgCDPK蛋白质特性分析 使用TMpred软件，预测RgCDPK蛋白的跨膜区，结果显示，RgCDPK蛋白可能存在一个跨膜螺旋，位置为309～327，方向由外到内。使用SignalP 4.1分析RgCDPK的信号肽，结果显示无明显信号肽。RgCDPK可能定位于叶绿体。通过在线软件对地黄RgCDPK蛋白进行磷酸化位点预测，结果显示，RgCDPK蛋白整个多肽链有71个磷酸化位点（>0.5），其中丝氨酸42个，苏氨酸23个，酪氨酸6个。

2.2.3 RgCDPK的结构预测 使用NPSA server在线软件预测RgCDPK的二级结构，结果表明RgCDPK蛋白由41.94%的α-螺旋、12.05%的延伸链、6.62%的β-转角和39.39%的无规卷曲组成。使用Swiss-model在线软件预测地黄RgCDPK的三级结构。同源建模结果显示（图2）， RgCDPK与拟南芥CDPK（SMTL ID：3q5i.1）相似度为33.94%，具有较高可信度（>30%）。

通过在线软件对地黄RgCDPK蛋白进行磷酸化位点预测，结果显示，RgCDPK蛋白整个多肽链有71个磷酸化位点（>0.5），其中，丝氨酸42个，苏氨酸23个，酪氨酸6个。

2.2.4 RgCDPK的系统进化及同源性分析 使用MEGA6.0构建系统进化树。拟南芥CDPK蛋白包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个亚族，其中AtCDPK1、AtCDPK2、AtCDPK26属于Ⅰ家族;AtCDPK15、AtCDPK19、AtCDPK23、AtCDPK29、AtCDPK33、AtCDPK34属于Ⅱ家族;AtCDPK13、AtCDPK14、AtCDPK24属于Ⅲ家族;AtCDPK16、AtCDPK18、AtCDPK28属于Ⅳ家族。如图3所示，RgCDPK与AtCDPK28处于同一分支，说明其可能属于CDPK Ⅳ家族，与拟南芥AtCDPK28同源性最近。

运用DNAMAN在线软件，将芝麻SiCDPK8、紫花风铃木HiCDPK等与地黄RgCDPK进行多序列比对。如图4所示，RgCDPK具有4 个典型的CDPK结构域：可变区、催化区、自抑制区和调控区。可变区位于N端，同源性极低;蛋白激酶区保守性较高，由约300 个氨基酸构成，因该区含有起催化作用的Ser/Thr 蛋白激酶序列，因此也可称为催化区，主要起与ATP 结合的作用;在C端有4个EF-hand结构，此为保守区，主要起促进Ca2+结合的作用，末端保守性較差。

2.3  RgCDPK的组织表达分析

使用荧光定量PCR技术分析地黄块根、叶、花瓣中的表达特性，结果见图5。由图5可知，RgCDPK在地黄块根、叶和花瓣中均有表达，在叶中的表达量最高，而在花瓣中的表达量最低。在根和叶中的表达量差异较小。

3 讨论与结论

本研究克隆得到一条新的完整的RgCDPK基因，其开放阅读框大小为1 770 bp，共编码589个氨基酸残基。对RgCDPK基因的结构及编码的蛋白进行分析发现，其保守结构具有4 个典型的可变区、催化区、自抑制区和调控区，符合钙依赖蛋白激酶典型结构特征。CDPK在植株中分布广泛，在根、叶、花、果实及种子等各器官中均能检测到CDPK基因的表达（Raices et al.，2003;白晓璟等，2019;雷蕾等，2019;Li et al.，2019）。本研究通过荧光定量PCR对RgCDPK在地黄不同组织中的特异性表达结果进行分析，发现RgCDPK在叶中表达量最高，其次是根，在花瓣中的相对表达量最少。铁皮石斛DoCDPK1也属于CDPK Ⅳ家族，但其在叶片中表达量最高，其次是茎，在根中表达量最低（盛况等，2017）。说明RgCDPK的表达具有组织特异性，且不同植物中的CDPK即使属于同一亚家族，其表达模式也可能不同。

本研究克隆得到了1条新的CDPK基因，系统进化分析发现，其可能属于CDPKD家族，与拟南芥AtCDPK28同源性最近。AtCDPK28缺失引起拟南芥Nacl抗性降低，而其超表达则增加拟南芥对

渗透胁迫的耐受性。同属于CDPKD家族的DoCDPK1在低温、ABA与盐胁迫均可被诱导，因此推测其可能在地黄渗透胁迫等逆境环境中发挥调节作用。连作障碍是指连续在同一土壤上栽培同种作物或近缘作物引起的植物生长发育异常（王刚等，2019），连作过程中植物也受到一定程度的胁迫。已经有研究发现钙信号系统在地黄连作障碍形成过程中扮演着重要的角色（郭冠瑛等，2013），而钙依赖蛋白激酶 （CDPK）（张毓露等，2012）在地黄连作的生理响应中可能也发挥着重要作用。CDPK11基因在连作地黄膨大前、中、后期的表达量均显著高于头茬地黄，而CDPK20在膨大中期连作地黄中表达量显著高于头茬地黄，其他时期均下调（杨楚韵等，2017）。这可能是不同CDPK蛋白通过相互补充和相互增益在地黄连作障碍的形成过程中承担不同的角色，从而介导地黄连作障碍的形成。RgCDPK基因作为地黄CDPK基因家族中的一员，可能在地黄连作反应中发挥一定的功能，但本研究未对其在地黄连作不同时期、不同组织中的表达特性进行研究，因此其如何参与地黄连作障碍中Ca2+信号转导及具体的转导途径等并不清楚，还需要进行深入的研究。

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（责任编辑 何永艳）