含抗生素废水脱氮处理中厌氧氨氧化工艺的应用及作用机制研究进展

张 茜，程雅菲,2，黄宝成,2，金仁村,2

(1. 杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 311121； 2. 杭州师范大学生态系统保护与恢复杭州市重点实验室，浙江 杭州 311121)

厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation，anammox)工艺具有无须外加有机碳源、脱氮负荷高和运行费用低等优点，是目前最为经济的生物脱氮工艺之一.但厌氧氨氧化菌(AnAOB)细胞产率低、生长缓慢(倍增时间长达11 d)、对外界环境条件敏感[1]，这极大地限制了其在实际工程中的大规模应用.近年来，我国制药和畜禽养殖产业发展迅猛，产生的废水中含有残留抗生素，极有可能会抑制anammox菌的活性，从而对anammox工艺带来负面影响.为此，本文通过分析抗生素的来源及污染现状，综述anammox处理含抗生素废水的脱氮效果，剖析抗生素对厌氧氨氧化菌的作用机制，以期为anammox工艺在抗生素废水处理中的工程应用提供依据.

1 抗生素的来源及污染现状

自青霉素被发现并应用于临床后，人类便开始大范围地应用抗生素.当前，由于抗生素的广谱抗菌效果，人类广泛使用该药物来治疗人和动物的感染性疾病.不仅如此，一些抗生素还被添加到饲料添加剂中来提高畜禽的免疫力，进而促进动物生长发育[2-3].目前，抗生素可由天然、半合成及人工合成等途径生产得到.虽然抗生素在畜牧产业的广泛应用为人类疾病控制以及畜牧养殖业发展做出了突出贡献，但它也带来了一系列环境风险.摄入人体或动物体内的抗生素类药物大多不能被充分吸收利用，通常会随排泄物进入污水处理厂或直接进入环境.虽然许多抗生素的半衰期较短，但由于频繁使用甚至滥用，导致其极易进入环境，形成“假持久性”现象[4-5]，最终成为环境中的一类新型污染物.我国是抗生素生产和使用大国，据报道，我国各级医院住院患者抗生素使用率超过70%，远高于世界卫生组织 (WHO) 所推荐的使用率(30%)，同时也高于欧美发达国家(10%)和其他发展中国家(42%)[6].由此看出，我国滥用抗生素的情况不容乐观.据估算，2003 年我国生产的青霉素高达 2.8 万吨，占世界总量的 60%；土霉素总生产量为 1 万吨，占世界总量的 65%[7].此外，抗生素在畜牧业中的使用也十分普遍，我国每年大约有5 000～7 000 吨土霉素和750～1 000 吨金霉素被用于动物养殖；农业中使用的抗生素种类已经包括了全部医用抗生素种类[6]，表明我国抗生素在农业中的使用也十分广泛.

含抗生素的废水一旦被排放至环境中，极有可能会诱导受纳水体中抗性细菌(antibiotic resistance bacteria，ARB)和抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)的产生.高浓度抗生素会对环境中的微生物产生抗生素选择压力，使某些微生物或病菌对抗生素产生抗药性，进而导致群落结构的改变，甚至对生态系统产生不良后果[8].此外，即使抗生素从一个区域移除，该环境中的ARGs和ARB也可能不会在短期内消失.不仅如此，有报道称，即使ARB被灭活，它携带的抗生素抗性基因在被释放到环境中后仍可长期保持活性，直到找到下一个受体细菌.

2 厌氧氨氧化工艺处理含抗生素废水脱氮效果

2.1 制药废水

在药品的研究和生产过程中会产生大量抗生素废水，这些制药废水的处理一直以来都是水污染防治的重点和难点.根据生产的药品种类和生产工艺的不同，制药废水主要可分为：抗生素、合成医药、中成药生产中产生的废水及各类医药制剂生产过程中的洗涤水[9].例如，抗生素废水主要由包括营养液、发酵残基、溶剂萃取过程中的萃取残液、溶剂回收后分散的蒸馏残液、离子交换过程中排放的吸附废液、水中细菌输液和发酵滤液中的不溶性抗生素等构成[10].一般来说，制药废水具有废水量大、水质复杂、毒性强、有机物和悬浮物浓度高、含盐量高、色度深、可生化性差等主要特点[11-12]，属于难处理的高浓度工业废水.

何永淼[13]采用两级厌氧-好氧-厌氧氨氧化组合工艺处理内蒙古某金霉素制药企业生产废水和某淀粉厂出水的混合废水.结果表明，该组合工艺对COD的总去除率介于94%～98%，对氨氮的去除效率高于90%，对总氮的去除效率介于80%～95%，取得了良好的处理效果.王钰楷[14]对一体式anammox工艺处理经厌氧和好氧预处理后的金霉素废水的效果进行了研究.试验结果表明，一体式anammox工艺处理二级厌氧稀释出水时，废水中氨氮和总氮的去除率均可达80%，总氮容积负荷最高可达1.0 kgN/(m3·d).在处理好氧出水试验中，氨氮去除率高于90%，总氮去除最高可达80%，总氮容积负荷为0.6 kgN/(m3·d).结果表明，采用anammox处理高氨氮抗生素废水从技术上和经济上均可行.傅海霞[15]对亚硝化-厌氧氨氧化工艺处理纳他霉素废水厌氧出水进行了研究，试验结果表明，在长污泥龄、低溶解氧的条件下，总氮平均去除率为78%，最高时可达92.5%，试验最终出水氨氮浓度为8.38 mg/L，亚硝酸盐氮浓度为9.37 mg/L，总氮浓度为38.12 mg/L，取得了良好的处理效果.

2.2 畜禽养殖废水

抗生素的滥用致使畜禽养殖废水中富含大量的抗生素及其代谢产物.由于缺乏有力的监管措施和科学的养殖知识，同时受到经济利益的驱使，畜禽养殖场普遍存在超剂量使用违规药品的现象[16].大多数的抗生素、激素难以被动物肠胃吸收，约30%～90%以代谢产物和原始状态排出[17].刘新程等发现江苏省的集约化养殖场的畜禽排泄物中，土霉素(OTC)的检出率和残留量分别为17.3%、1.95 mg/kg，金霉素(CTC)的检出率和残留量分别为30.9%、 9.75 mg/kg.据报道，肥料中土霉素的浓度为0.003～250 mg/L[18-19].如此高浓度的土霉素和氨同时出现在猪场废水消化液中，给废水生物脱氮工艺带来巨大的挑战.

Zhang等[20]用模拟畜禽养殖废水研究了诺氟沙星(NOR)对anammox工艺的影响.结果表明，0.001 mg/L诺氟沙星投入后立即对微生物产生来了抑制， anammox的总氮去除负荷(NRR)降低了27.5%，比厌氧氨氧化活性(SAA)降低了30%；但停止诺氟沙星(NOR)投加并运行一个月后，反应器性能恢复到初始水平.磺胺类抗生素是另一种被广泛应用于农牧行业的抗生素.Du等[21]研究了不同浓度磺胺类抗生素对anammox的影响.结果表明，在低浓度磺胺甲嘧啶(SM)和磺胺地托辛(SDM)条件下(低于3 mg/L)，anammox菌未受影响，主要是由于anammox菌表面分泌较多的EPS可保护其免受抗生素的侵害；在5～ 7 mg/L浓度下，SDM对anammox菌产生了明显的抑制作用，Candidatus Brocadia的丰度由2.57%下降到0.39%.当SDM和SM浓度升高至5～9 mg/L时，anammox进一步受到了抑制，氨氮积累严重.

3 抗生素对厌氧氨氧化菌的作用机制

3.1 胞外聚合物(EPS)的变化

Anammox颗粒由菌体和胞外多聚物(extracellular polymeric substance，EPS)组成.tif 的主要成分是蛋白质和多糖，还有少量脂质、核酸以及腐殖酸类物质[22]，由颗粒中上菌体合成并分泌产生，不仅可用作黏结剂促使细胞团聚，使污泥颗粒化，通常还是微生物细胞的第一道屏障，直接与水环境中的物质接触和相互作用，在外源毒性物质刺激下，微生物将分泌更多的EPS，以保护自身，减轻其毒害作用.tif 在anammox颗粒污泥的形成、维持和工作中发挥着重要作用，与其两大成分密切相关.Liu和Hou等[23-24]发现，蛋白质含量与细菌细胞表面的疏水性呈正相关；然而，另一些研究[25]表明，多糖对anammox的颗粒化起着更重要的作用.此外，Zhang等[26]对3种广谱抗生素阿莫西林、氟洛芬和磺胺二甲嘧啶的抗性研究表明，在长期实验过程中，前3 d内污泥活性降低了一半，但随后，anammox菌逐渐恢复，污泥活性和血红素水平提升，EPS水平提升，高于初始水平.

另一方面，厌氧氨氧化菌的胞外聚合物防御机制有助于增加其耐受性.Zhang等[27]研究表明，细胞外产物的变化是厌氧氨氧化菌在抗生素胁迫下所发生的明显反应.胞外聚合物(EP, extracellular products, consisting of SMP and EPS)基质中含有丰富的官能团，如羧基、磷基、胺基和羟基，它们在中性pH下带负电荷，能够通过静电吸引或其他相互作用与多价阳离子形成有机金属配合物[28].细胞EPS含量的升高有助于增强其与相邻厌氧氨氧化菌细胞的作用力，形成交联网络，从而防止重金属进入细胞.OTC有电子供体基团，能与金属离子形成络合物(如Cu-OTC络合物)[29]，该络合物可进一步通过静电力吸附在anammox颗粒表面，形成EP -Cu-OTC络合物.Zhang等[27]发现，EPS产量的变化与厌氧氨氧化菌的特异生长率呈正相关.这些行为可以认为是厌氧氨氧化菌减少抗生素摄入的防御策略.

3.2 干扰蛋白质合成

不同种类抗生素对微生物的抑制机理不同，可干扰细胞壁合成的抗生素有青霉素、先锋霉素、万古霉素和环丝氨酸等；干扰核糖体蛋白质合成的抗生素有土霉素、庆大霉素、链霉素和氯霉素等；破坏细胞质膜结构的抗生素有多黏菌素等[30-31].

研究表明，青霉素G对厌氧氨氧化菌活性的短期抑制作用较小，但在长期作用下会对细菌产生显著的抑制[32].青霉素是β-内酰胺类抗生素，主要通过抑制转肽酶和细胞壁上肽聚糖的合成，抑制革兰氏阳性菌[33].由于厌氧氨氧化菌细胞壁不含肽聚糖，短期实验中青霉素G几乎不会对厌氧氨氧化菌的活性产生影响[34].但厌氧氨氧化菌的基因组中存在编码肽聚糖合成以及肽聚糖结合蛋白的基因[35]，所以在长期运行的过程中，青霉素G可能通过抑制肽聚糖的合成而抑制厌氧氨氧化菌的活性.

土霉素对厌氧氨氧化活性的短期与长期抑制特性和青霉素类似[36-37].土霉素属于四环类抗生素，四环类抗生素可与核糖体30S亚基的α位特异性结合，使氨酰基-tRNA无法进入α位，抑制核聚糖体形成，从而抑制细菌的生长[37].对于厌氧氨氧化菌而言，颗粒污泥对底物的传质具有阻碍作用，从而有助于缓解土霉素的抑制作用[38].Tang等[39]研究表明，厌氧氨氧化颗粒污泥表面含有大量胞外聚合物，这些胞外聚合物电负性强，可以吸附溶液中的有毒物质，在一定程度上阻碍其与细胞的直接接触.此外，Tan等[40]研究表明,微生物在高度聚集的条件下其基因表达能力更强，因此，微生物对不利环境的适应能力也会更强.厌氧氨氧化菌在颗粒污泥中的聚集密度较高，可能会使土霉素对厌氧氨氧化菌的抑制作用降低.

多黏菌素是从多黏杆菌培养液中获得的多肽类抗生素，对多数革兰氏阴性菌有杀灭作用.多黏菌素含有带正电荷的游离氨基，革兰氏阴性菌细胞膜上有带负电荷的磷酸根，带正电荷的游离氨基和带负电荷的磷酸根结合，使细菌细胞膜面积增大，通透性增加，细胞内的磷酸盐、核苷酸、氨基酸等成分外漏，从而导致细菌死亡.Ding等[41]研究了硫酸多黏菌素B对污泥厌氧氨氧化活性的影响，结果表明,污泥厌氧氨氧化活性的半抑制浓度(IC50)为10.2 mg/L.马静等[42]研究表明，青霉素G钠、土霉素盐酸盐和硫酸多黏菌素E对厌氧氨氧化颗粒污泥活性的抑制作用依次增强.在批次实验中，虽然3种抗生素抑制特性不同，但是厌氧氨氧化颗粒污泥对它们都具有较好的耐受能力.

3.3 耐抗生素基因

由于抗生素残留的选择性压力[43]，抗生素耐药细菌不断发展.如果抗生素耐药基因(ARGs)被转移到危险的病原体上，抗生素的效力可能会降低.即使在没有选择压力的情况下，ARGs也可以存在于自然环境中[44-46].在国际上，ARGs和残留的抗生素已经被认为是新兴的环境污染物[47-48].

微生物对抗生素产生耐药性的机制主要有：1)抗生素通过降解或取代活性基团而失活；2)抗生素不能与抗生素靶点的修饰联合使用，以显示耐药性；3)抗生素通过特异性或通用的抗生素外排泵排出细胞，降低细胞内抗生素浓度，表现出耐药性；4)其他耐药机制包括在细胞膜上形成多糖，减少抗生素进入细胞[49].

外排泵基因的耐药机制及其对耐药的贡献已被广泛报道.然而，这只是微生物的一种自我保护机制，并不能降低抗生素的含量.酶修饰基因是OTC降解的主要机制之一，它可以通过合成的氧化还原酶对四环素进行化学修饰使其失活.Shi等[50]研究表明，通过比较外排泵基因(teta、tetB、tetC)和酶修饰基因(tetX)变异的丰度，可以推测anammox微生物主要通过泵外排来抵抗OTC的生物毒性.tetX含量越高，说明anammox混合培养具有降解OTC的潜力.

Tao等[51]研究表明，污水处理厂可部分减少耐药菌的扩散，沉降等附加处理对ARGs的去除效果影响不大.在大多数农场，经过好氧处理后，ARGs的绝对数量会下降.较早的一项研究发现，通过活性污泥和生物过滤处理，水中tet基因的去除率可达97%以上[52].Engemann的另一项研究发现，tet基因的去除率与光照射显著有关[53].因此，在好氧池中，氧气和光照可以减少抗性细菌的数量.此外，延长好氧装置的处理时间有助于减少抗生素抗性细菌向环境的释放.鉴于污水处理流程以及抗性基因种类上存在的差异，通过该方式实现的抗生素抗性细菌的去除率为18.15%～99.99%.

4 总结和展望

近年来，人类大量使用含抗生素药物来治疗人和动物的感染性疾病，并且也将该药物添加到饲料中从而提高畜禽免疫力，促进动物生长发育.但是，摄入人体或动物体内的抗生素类药物大多不能被充分吸收利用，通常会随排泄物进入污水处理厂或直接进入环境，成为环境中的一类新型污染物.另外，含抗生素的废水一旦被排放至环境中，极有可能会诱导受纳水体中抗性细菌和抗性基因的产生.高浓度抗生素会对环境中的微生物产生抗生素选择压力，使某些微生物或病菌对抗生素产生抗药性，进而导致群落结构的改变，甚至对生态系统产生不良后果.目前，anammox工艺无法直接用于处理抗生素废水，主要应用两级厌氧-好氧-厌氧氨氧化、一体式anammox工艺、亚硝化-厌氧氨氧化等工艺处理.抗生素废水可能会通过干扰蛋白质合成等过程对anammox处理过程产生抑制.与此同时，anammox细菌可能通过胞外EPS的分泌以及抗性基因的产生对抗生素产生抗性.

但是，在抗生素胁迫下厌氧氨氧化菌的代谢响应机制仍然不明，抗生素抑制anammox微生物的机制仍需进一步研究.因此，对于anammox而言，要尽可能降低抗生素对其的毒性，为此，要发展高效经济的预处理技术，其中高级氧化技术有一定可行性，但如何优化工艺参数实现高级氧化与anmmox的有效耦合仍然需要进一步研究.近年来，发展迅速的微生物测序和组学分析手段可作为机制解析的有力工具.此外，Pruden等[47]通过广泛研究表明，抗生素抗性基因已经成为一种新的环境污染物，并提出环境工作者应该重视抗生素抗性基因引起的生态问题，通过对抗性基因 (ARGs) 深入研究，逐渐认识了抗生素抗性基因对微生物基因和对人类生活环境的危害.针对如何降低抗性基因的产生，已经有了一些调控策略.例如通过在好氧池中增加溶解氧浓度以及光照将有助于减少抗生素不敏感细菌向水环境的释放.未来，环境工作者仍然需要将高级氧化技术和联合消毒技术等应用到实际操作中，从而提高抗性基因的去除效率，实现抗性基因的有效控制.

厌氧氨氧化在废水处理系统和自然生态系统中发挥了巨大作用，对于全球氮循环具有重要影响，目前已有研究分析了厌氧氨氧化对局部生态系统中氮循环的贡献率，深入对anammox细菌抗生素抗性基因的研究具有十分重要的意义.