充血性心力衰竭中医证候动物模型研究思考

李小茜，何建成

(上海中医药大学，上海 201230)

充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)多发于各种器质性心血管疾病的终末阶段，为临床常见的重大疾病之一，发病率与致死率逐年攀升，如何积极有效的防治引发临床研究者的关注。中医药在CHF的防治方面发挥着越来越重要的作用[1]，病证结合是中医证候研究的指导原则。动物实验是本病发病机制及其中医证候研究的重要基础，其中动物模型的制备则为关键所在。

目前有关CHF疾病的动物模型制备方法研究较多，亦有研究者对中医证候的动物模型制备进行探索。近年来，随着中医药现代化研究的发展与深入，制备符合中医证候特征的病证结合的动物模型，对于进一步揭示证候的物质基础、探求中药药物的靶向疗效机制具有较重要的理论指导以及临床实际意义。

1 CHF动物模型的制备

建立符合人类CHF病理生理过程且稳定的动物模型，有助于更好地开展本病机制及药效的研究。对于目前本病的防治及新的治疗手段的研发而言，选择合适的动物模型亦极为关键。总体而言，CHF的动物模型包括心肌缺血型、压力负荷型、容量负荷型和心肌病变型等，能够较好的复制本病的病理生理改变[2-3]，制备方法主要有药物诱导和手术制备等。

1.1 实验动物的选择

对于每一个基础实验的模型制备而言，实验动物的选择都十分重要，亦将直接影响实验结果的可信度及科学性。

一般而言，选择实验动物的原则主要根据相似性、经济性、标准化、特殊性、模型化和可重复性等[4]。CHF的动物实验研究所选用的动物主要有猪、羊、犬、家兔、大鼠、小鼠等。猪的心血管系统与人类相似，可以较好地反映CHF疾病的分子与生理表型[5]。犬的血液循环系统发达，大鼠体型小、价格低廉，且易操作，小型啮齿类动物和人类之间的心肌能量代谢、收缩能力等方面也相对相似[6]，小鼠模型在CHF分子、细胞学基础与药效学研究等方面发挥重要作用[7]，可见各类实验动物有各自的优势。

总体来讲，较大动物的心脏解剖结构虽然更接近人类，但是存在造模成本较高、操作难度较大等问题，实际应用较少[8]。CHF实验动物的选择应根据造模方法(药物法或手术法)及其易操作性等来决定。建立稳定且可靠的CHF动物模型，成功选择动物、模拟类似人体CHF发病病理过程都是关键。一般认为，大鼠的电生理特性与人相似，且价格经济，便于操作。此外，由于其造模时间短、模型复制稳定等优势，研究人员较常应用Wistar大鼠于CHF的模型制备[9]。

1.2 药物诱导制备CHF模型

药物法制备模型即通过药物诱导导致实验动物CHF发生，常用药物包括阿霉素、异丙肾上腺素、乙醇等。

阿霉素(ADR)是一种广谱抗肿瘤化疗药物，静脉注射数小时或数日即可能造成剂量依赖性且不可逆转的慢性的心肌损害作用，进而导致CHF[10]。有研究指出ADR这种损伤心肌机制的发挥有可能与体内自由基的释放、线粒体的损伤以及代谢失衡相关[11]。有学者应用腹腔注射ADR的方法制备CHF模型，发现这种方法的优点是简单易行，而且可以较精准预测出CHF出现的时间。但是同时因为ADR的剂量依赖性，短期内较大剂量的腹腔注射给药，可能会使动物的死亡率增加，导致模型的成功率较低，因此研究者更经常使用小剂量/低浓度、多次给药的方法[12-13]。研究表明应用ADR制备的CHF动物模型，可出现心室增大、心室壁变薄以及射血分数(LVEF)减低等病变，适合用来探究心肌病、CHF的发病机制，或某一种药物或治疗措施的评估等。吴慧颖等[14]改变ADR入血方式，采用尾静脉注射法制备CHF模型，两周后检测心脏指数、血流动力学参数、组织病理学等指标，均提示诱导成功，且未发现腹水、腹膜肿胀等腹腔刺激的现象，提供了一种简单易行的制备方法。近来，ADR还被运用到斑马鱼胚胎上，建立心脏毒性、心脏损伤模型，进而探讨其中发生机制[15]。

异丙肾上腺素(ISO)属于β受体激动剂，临床应用能提高心率、增加心肌收缩力，如果长期大量的应用可能会导致心肌细胞的纤维化、心肌重构，导致CHF的发生。目前应用ISO制备CHF模型有皮下注射和腹腔注射两种方式，无创伤，易于重复且诱导时间较短，但是，动物的批次、给药途径的变化以及药量的差异都会影响模型制备的效果，所以实际制备的时候必须进行预实验，最终确定实际的实验方案。ISO诱导CHF的模型主要是模拟交感神经兴奋进而引发CHF的病理过程，实际经常用于治疗药物的筛选以及药效发挥和交感神经兴奋或抑制的相关性等实验中。罗时珂等[16]实验探讨皮下注射ISO制备CHF大鼠模型的有效剂量。给药4周后，观察大鼠左室收缩末期内径、血清脑钠肽(BNP)水平、心脏指数以及死亡率等指标的变化。实验结果发现，CHF的大鼠模型制备以皮下注射ISO 2.5 mg/(kg·d)较为合适。 另外，王洋等[17]通过对ISO诱导造模的CHF大鼠给药氧化苦参碱，发现氧化苦参碱可以逆转肌钙蛋白I水平的异常增加，改善左心室重构，明显改善ISO导致的心肌损伤等病理改变等。

此外，还有研究者应用乙醇诱导制备CHF模型。乙醇中毒会导致乙醇及其代谢物沉积在血中，致心肌细胞凋亡、使心肌收缩力减弱，左心房静息后的增强效应受到抑制，损伤心血管，最终导致CHF。乙醇诱导CHF模型的作用机制可能与兴奋交感神经系统、肾素-血管紧张素-醛固酮(RAAS)系统、损伤血管内皮细胞以及加剧细胞凋亡等有关[18]。这种方式造模的诱导时间虽然较长，但是以恒速进行静脉注射的话，则可控性良好。刘昊琛等[19]曾对家兔恒速、颈外静脉注射乙醇，结果发现造模后，家兔的动脉收缩压、舒张压、左室收缩压以及左室内压上升与下降的最大速率均明显下降，而且心肌的病理变化符合CHF的病理特征，值得进一步探索研究。

1.3 手术制备CHF动物模型

目前常用于CHF动物模型制备的手术方法包括腹主动脉缩窄法与左前降支冠状动脉结扎法等。

应用腹主动脉缩窄法来建立CHF模型，是应用注射针头或者缩窄环类等工具，结扎部分腹主动脉，促使主动脉缩窄，进而使外周循环阻力增加，最终导致压力超负荷CHF的方法[20]。这种造模方法在CHF的基础性研究中已经有较长时间的应用，手术方法较为简单，模型亦确切，是研究CHF发病以及病理变化机制、药物疗效等常用且较理想的模型制备方法。对于这种方法而言，动脉的缩窄程度影响着心脏的损伤程度，有研究表明，7号注射针头可造成Wistar或SD大鼠约70%～80%的腹主动脉缩窄[21]；8号注射针头则能造成50%～60%的腹主动脉缩窄[22]；而9号针头可使得动物腹主动脉缩窄减少达到35%～50%[23]。

左前降支冠状动脉结扎术是通过手术，结扎动物的左冠状动脉或左前降支及左旋支，导致心肌缺血，诱发心肌重构，最终导致左心衰竭。这种造模方法的操作难度比较大，需要经过长期训练的实验人员才能熟练掌握。此外，采用这种方法制备CHF模型时，需结合彩超检测心功能指标、心肌组织病理学分析，进而观察动物心室重构、心肌纤维化甚或心肌梗死的程度。辛伟等[24]通过在小型猪冠状动脉前降支的近端放置Ameroid缩窄环的方法，较为成功地制备慢性心肌缺血性的CHF动物模型。对于在不同位置结扎冠状动脉对大鼠CHF模型的影响，陈剑等[25]研究发现，进针深度约0.5 mm左右，常规位结扎(距左冠状动脉开口2 mm)可导致较大心肌梗死的面积、较显著的血液动力学改变及CHF等病理变化，但是造模的死亡率较高，达33%～60%左右。采用较低位置(6 mm)结扎左冠状动脉的方法则能提高模型的存活率到85.7%左右，明显节约实验的工作量且节省实验成本，值得推广应用。

2 CHF中医证候动物模型的制备

随着中医药现代化研究的不断深入，单纯的疾病动物模型远不能满足基础研究的需要。中医证候的动物模型研究是从糖皮质激素诱导的阳虚证动物模型开始，模型的评价可由动物的四诊表征即症状和体征反映。比如根据模型动物毛发缺少色泽、蜷缩弓背、活动力差、懒动喜卧、行动缓慢等评价为肾阳虚证[26]。这种评价方法虽然可直观反映动物状态，且贴近中医临床辨证方法。易受主观因素影响、动物在行为表现等方面与人类存在差异，导致四诊信息的采集准确性受到影响。

此外，中医证候的动物模型研究至今虽已达几十年之久，但是从中医学研究的趋势来看，单纯的证候模型缺乏对疾病完整性的反映，且证候的致病因素较易消减，而病证结合的思路则可以较好地弥补这一不足，有研究人员从病证结合角度提出综合评价复合模型的中医证候指标及微观免疫学指标，制备免疫力低下复合证候动物模型用于现代免疫学及中医学的相关研究[27]。

有关CHF中医证候的动物模型研究，蔡虎志等[28]认为建立CHF心阳虚证的病证结合动物模型，可以应用临床医学的疾病模型与中医的证候模型相互结合的方式，并通过客观指标检测与药物反证等确定，但是在如何选择客观指标与反证药物方面仍需大量探索与实践。童妍[29]选取雄性SD大鼠，腹腔注射ADR 4 mg/kg，每周1次，连续6周，结果发现，与正常组比较，模型组大鼠动脉收缩压、舒张压、左室收缩内压显著下降，左室舒张末压明显增高，左室内压、左室压力最大上升及下降速度显著减小，且出现精神不振、多蜷缩、反应迟钝，活动、进食减少，竖毛且毛发无光泽、拱背、小便量多、大便稀薄等阳虚症状，进而提出这种方法可以制备CHF心阳虚证大鼠模型。赵明镜等[30]提出CHF心气虚证的病证结合动物模型的制备思路，认为心肌缺血冠状动脉结扎法造成心气虚证的动物模型符合临床流行病学、研究报告及实验研究的成果，并通过观测实验动物的一般情况，如体重变化、饲料的消耗、活动能力、精神体能、毛发情况等，定性角度来评价该模型的证候属性。

可见，有关CHF中医动物模型的制备研究不多，可复制性与推广性更是少之又少，研究人员提出较多思路，为更深入、更适宜的制备方法探索提供参考。

3 基于病证结合的CHF中医证候动物模型的研究与展望

CHF的病因与发病机制纷繁复杂，动物模型的制备方式亦是多种多样。随着人们对中医药防治CHF机制研究的关注与深入，符合中医学特色和临床实际要求的，CHF病证结合动物模型亟待全面建立与发展。病证结合是中医证候研究的指导原则，是故建立具有临床中医证候特征的病证结合的动物模型，对探究中医证候的物质基础、深入了解中医药疗效发挥机制等均有重要的意义。

本课题组长期致力于CHF的基础与临床研究，较早地建立了兔气虚血瘀型CHF动物模型[31]，结果证实模型组动物在发生心肌形态学改变的基础上有显著的血流动力学异常，符合CHF的特点；同时模型组动物具有符合中医气虚血瘀证的表现，存在血瘀证的客观指标，为之后的深入研究打下坚实基础。

我们认为，病证结合动物模型应该能够较好地体现中医对疾病发展规律的认识以及中医证候的阶段性特征，即西医的病和中医的证相结合或一体化共存的模型。无论是西医的疾病抑或是中医的证候，对于一个患者而言，出现的是同一种病理表现，虽然西医与中医的辨病、辨证理论体系大相径庭，但由于研究内容与目的相同，必然存在相通之处。

基于此，笔者认为首先要建立确切的CHF动物模型，通过四诊信息的判定、对标病因病机、客观指标协同、治法方药的反证等，同时结合动物实际表现等评价标准，共同来证明疾病模型确立后所表现出的中医证候类型，即为CHF病证结合的动物模型。这种动物模型的干预因素相对较少，病理机制较单一，用之开展实验研究可保证研究结果的可靠性，而且结合中医学特色，证明为与该疾病模型联系最为直接的证候。在这个思路指导下，课题组在帕金森病(PD)病证结合动物模型的制备方面持续深入探究，通过模拟病因(6-羟基多巴胺立体注射于大鼠右侧纹状体)、模拟症状(对照震颤、肌强直、二便、舌象等临床症状，推断PD模型大鼠的证候属性)、客观指标验证(氧化应激状态)、药物反证(天麻钩藤饮、桃红四物汤、涤痰汤等)，较早制备了阴虚动风证PD病证结合大鼠模型，证实模型具有疾病和证候的双重特征，并从不同时间点，从功能、细胞、蛋白、分子生物学角度持续进行深入的生物学基础与药效研究[32]。目前我们也在通过不同的中药药物验证，摸索制备CHF常见证候的病证结合动物模型。

总而言之，CHF病证结合的动物模型是本病中医药实验研究的重要前提与保障。众所周知，动物模型用于实验研究，不能完全复制出疾病的自然发生发展进程，且每种方法制备的模型都具有各自的优势和局限性。我们应该不脱离中医学的理论指导以及研究思路，同时结合自身研究项目的需求，权衡利弊，选择较适宜的模型制备方法。我们研究发现，CHF临床上的中医证候呈现动态演变的趋势，早中晚期都有不同的证候类型，这一结论亦影响着CHF病证结合动物模型的制备，即要考虑时间因素导致的动态证候，在实际操作过程中纳入时间因素、控制影响因素，尽量提高模型成功率，保证其可复制性，为之后的基础与临床研究夯实基础。