瓜子金酸性多糖的含量测定方法研究

刘 蕾，刘富岗，冯素香，5，6*

(1.郑州大学附属儿童医院 药学部，河南 郑州 450053；2.河南省儿童医院 药学部，河南 郑州 450053；3.郑州儿童医院 药学部，河南 郑州 450053；4.河南中医药大学 药学院，河南 郑州，450046，5.呼吸疾病诊疗与新药研发河南省高校协同创新中心，河南 郑州 450046；6.河南省中医药防治呼吸病重点实验室，河南 郑州 450046)

瓜子金系远志科植物瓜子金的PolygalajaponicaHOUTT.的干燥全草，具有祛痰止咳、活血消肿、解毒止痛的功效，临床用于治疗咳嗽痰多，咽喉肿痛；外治跌打损伤，疔疮疖肿，蛇虫咬伤[1]。瓜子金所含化学成分主要有皂苷类、黄酮类、生物碱、甾醇、脂肪油、挥发油、四乙酸酯等成分[2-5]。对其中的酸性多糖类成分的研究鲜有文献报道，为了加深对瓜子金酸性多糖的研究，本实验对瓜子金酸性多糖的含量测定方法进行了考察，采用间羟基联苯法[6]以D-半乳糖醛酸为对照品测定瓜子金酸性多糖的含量，以期为瓜子金酸性多糖的进一步研究提供参考依据。

1 仪器与试药

TU-1810型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；Satorius-CPA225D十万分之一天平(奥多力斯科学仪器有限公司)；DZF-300型电热恒温鼓风干燥箱(郑州长城科工有限公司)；D-半乳糖醛酸对照品(上海博顿生物化工有限公司)；浓硫酸、硼砂、间羟基联苯等试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 溶液的制备

间羟基联苯溶液的制备：称取间羟基联苯0.15 g，精密称定，以0.5%NaOH溶液溶解，定容至100 mL，配制成约1.5 mg/mL的间羟基联苯溶液，4 ℃冰箱中放置1个月，备用。

四硼酸钠-硫酸溶液的制备：称取0.477 g 硼砂，精密称定，以浓H2SO4溶解，定容于100 mL量瓶中，制成0.012 5 mol/L的四硼酸钠-硫酸溶液，备用。

D-半乳糖醛酸标准品储备液的配制：称取105 ℃烘干至恒重的D-半乳糖醛酸标准品7 mg，精密称定，加蒸馏水使溶解，定容于100 mL的容量瓶中，配制成700 μg/mL的D-半乳糖醛酸标准品储备液，置于4 ℃冰箱中备用。

2.2 最佳测定波长的选择

精密吸取D-半乳糖醛酸标准品储备液0.5 mL置于具塞试管中，加蒸馏水至2 mL，冰水浴冷却，加四硼酸钠-硫酸溶液5 mL，混匀，沸水浴加热10 min，冷却至室温，加入间羟基联苯溶液100 μL，涡旋振荡5 min，室温放置1 h后，于200～900 nm进行全波长扫描。由扫描结果可知，D-半乳糖醛酸标准品在525 nm处有最大吸光度，故选525 nm为测定波长。

2.3 供试品溶液的制备

取瓜子金药材，粉粹成粗粉，加8倍量无水乙醇85 ℃回流提取2次，每次1.5 h，过滤，药渣挥干，加10倍量的蒸馏水95 ℃水浴回流提取2次，每次2 h，过滤，合并滤液，滤液50 ℃减压浓缩，浓缩液采用木瓜蛋白酶结合三氯乙酸法[6]脱蛋白，加乙醇至含醇量达80%(V/V)，静置过夜，抽滤，真空干燥，得到瓜子金酸性多糖，备用。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线的建立 精密吸取D-半乳糖醛酸标准品储备液10 mL置于100 mL容量瓶中，蒸馏水定容，摇匀，得70 μg/mL的D-半乳糖醛酸标准品溶液。分别精密吸取D-半乳糖醛酸标准品溶液0，0.2，0.5，0.8，1.0，1.5，2.0 mL于25 mL具塞试管中，补充蒸馏水至2.0 mL，冰水浴冷却，加四硼酸钠-硫酸溶液5 mL，混匀，沸水浴加热10 min，冷却至室温，加入间羟基联苯溶液100 μL，涡旋振荡5 min，室温放置1 h，以蒸馏水为空白于525 nm测定吸光度，以D-半乳糖醛酸浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程为：y=0.012x-0.053，r=0.999 7(n=6)，结果表明，D-半乳糖醛酸浓度在7.0～70.0 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。见图1。

图1 D-半乳糖醛酸标准曲线

2.4.2 精密度实验 取40.00 μg/mL的D-半乳糖醛酸标准品溶液1.0 mL，按照“2.4.1”项下操作，连续测定5次，计算吸光度的RSD值为0.513%，表明仪器精密度良好。结果见表1。

2.4.3 重现性实验 配制50.00 μg/mL的D-半乳糖醛酸标准溶液6份，各取1.0 mL入具塞试管中，按照“2.4.1”项下操作，测定酸性多糖含量，计算吸光度的RSD为0.836%，表明该方法重现性良好。结果见表2。

表1 精密度实验结果

表2 重复性实验结果

2.4.4 稳定性实验 取浓度为50.00 μg/mL的D-半乳糖醛酸标准溶液1.0 mL，依“2.4.1”项下操作，每隔15 min测定吸光度一次，连续测定2 h，其相对标准偏差RSD值为0.212%，表明样品在2 h内具有良好的稳定性。结果见表3。

表3 稳定性实验结果

2.4.5 加样回收率实验 准确精密称取样品瓜子金酸性多糖(酸性多糖含量为4.62%)6份，每份约3.5 mg，分别加入浓度为52.5 μg/mL的D-半乳糖醛酸标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，依照“2.4.1”项下操作，测定吸光度，计算回收率，得平均回收率为99.8%，RSD=0.96%。实验结果见表4，可见该方法具有良好的回收率。

表4 回收率实验结果

由以上结果可知，该方案的精密性、重现性、稳定性和加样回收率实验均稳定良好，该实验方法稳定、成熟，可用于瓜子金多糖含量测定的进一步研究。

2.5 瓜子金酸性多糖含量测定

取不同批次的瓜子金药材，按照“2.3”项下方法制备瓜子金酸性多糖，按照“2.4.1”项下操作，测定吸光度，计算瓜子金酸性多糖的含量，结果见表5。

表5瓜子金酸性多糖含量测定

3 讨论

多糖是一类由单糖聚合而成的高分子化合物，其具有增强免疫、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗疲劳等作用[7-8]。在植物中不仅存在中性多糖还存在酸性多糖，酸性多糖是目前生物活性最多，应用最广泛的一类生物活性多糖，其结构主要含有糖醛酸等基团，具有降血脂、免疫调节、抗凝血、保肝等作用[9-12]。对于酸性多糖的含量测定常采用的方法有咔唑法和间羟基联苯法[13]，本实验选用间羟基联苯法测定瓜子金酸性多糖的含量，实验结果表明，所建立的瓜子金酸性多糖的含量测定方法操作简单，灵敏度高，重复性好。

对不同批次的瓜子金药材中酸性多糖的含量测定结果表明，本实验所建立的瓜子金酸性多糖的含量测定方法科学可行，可用于瓜子金酸性多糖的含量测定。