d-柠檬烯对柑橘全爪螨的作用方式和生物活性

毕晓阳，张肖肖，刘雅倩，黄继光

（华南农业大学 天然农药与化学生物学教育部重点实验室，广东 广州510642）

柠檬烯是一种常见的单环单萜类植物精油，具有d型、l型和dl型3 种构型[1]，无色油状液体，易溶于丙酮、乙醇等有机溶剂，有特殊的柠檬芳香味[2-4]。d-柠檬烯是自然界常见的一种构型，又称d-苎烯，具有多种活性，可从柑橘类或柠檬类的果皮或果肉中提取。研究表明d-柠檬烯具有抗虫、抑菌、消炎、减痛、预防和治疗癌症的作用[5-8]，也可作为增香剂、抗氧化剂等添加到食品中，还可作为绿色提取剂及空气清洁剂等[9-10]。

随着农药往高效、低毒方向发展，以及植物精油具有多种活性的特点，从植物中提取的d-柠檬烯被广泛地用于害虫防治，如螨虫、粉虱、蚧壳虫等，奥罗阿格瑞国际有限公司现已登记d-柠檬烯原药和5%可溶液剂。柑橘类水果中普遍存在的d-柠檬烯通过什么方式对危害柑橘的红蜘蛛表现出生物活性，未见相关报道。为弄清这个问题，本文重点测定了d-柠檬烯对柑橘全爪螨的作用方式和生物活性，旨在为柠檬烯类精油的使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源及饲养

柑橘全爪螨（Panonychus citriMcGregor）采集于华南农业大学教学科研基地柑橘园，将成螨采集回来接种到干净未接触任何药剂的柑橘苗上饲养扩繁。饲养环境：温度（28±1）℃，相对湿度（65±5）%，光周期16∶8。

1.2 供试试剂

d-柠檬烯：含量95%，购于悌希爱（上海）化工发展有限公司。鱼藤酮：含量98%，购于Sigma。丙酮等常用有机溶剂均为分析纯，市售。

1.3 药剂配制

d-柠檬烯用少量丙酮溶解，再用0.1%吐温-80 水溶液逐级稀释至所需浓度。控制最终溶液中丙酮含量不超过2%。

1.4 测定方法

1.4.1 成螨采用FAO 推荐的玻片浸渍法进行：将双面胶粘贴在载玻片上，用零号毛笔挑取大小一致、健康活泼的柑橘全爪螨雌成螨，将其背部粘在双面胶上，然后置于光照培养箱中培养观察2 h，剔除死亡和不活泼的螨虫。再将带有螨虫的载玻片在药液中浸渍5 s，用滤纸吸干虫体周围药液，晾干后置于培养箱中，24 h 观察，记录死亡情况。

每处理20 头雌成螨，3 次重复，对照用相同含量的有机溶剂和乳化剂处理。

1.4.2 若螨采用喷雾法进行：准备干净平整的豇豆叶片，剪成3 cm×5 cm 大小，叶背朝上，置于铺有滤纸的培养皿中，接入大小一致的柑橘全爪螨若螨。用手持小型喷雾器将药液均匀喷至叶片和螨虫表面，至叶片表面刚好布满雾滴为止。处理后自然晾干，转移至光照培养箱进行培养观察，24 h 调查死亡情况。每处理20 头，3 次重复，对照用相同含量的有机溶剂和乳化剂处理。

1.4.3 杀卵采用浸渍法进行：准备新鲜干净3 cm×5 cm 大小豇豆叶片，铺于培养皿中，每个培养皿中接入产卵盛期的柑橘全爪螨成螨30 头，置于培养箱中产卵24 h 后，剔除雌成螨，然后将带有卵的叶片小心地在不同浓度的d-柠檬烯溶液中浸渍5 s，取出放回原处晾干。在双目解剖镜下记录各处理卵的数量后，转移至正常环境中培养，48 h 后观察卵孵化情况，未孵化的卵粒视为死亡，计算杀卵效果。每处理重复3 次，用相同含量的有机溶剂和乳化剂处理当做空白对照。

1.4.4 产卵抑制采用喷雾法进行：将处于产卵期的雌成螨接入到新鲜、干净的豇豆叶片背面，立即用喷雾器将不同浓度药液喷至叶片表面，至叶片表面均匀布满雾滴为止。然后将处理的雌成螨置于培养箱中培养、观察。72 h 调查卵的数量。每处理20 头，3 次重复。对照用相同含量的有机溶剂和乳化剂处理。

1.5 盆栽

采用喷雾法进行。用直径12 cm 和高度16 cm 的塑料钵种植豇豆，待植株长至4～6 叶后，选取长势基本一致的豇豆进行盆栽试验。每个盆栽保留1 颗生长良好的植株，选取3 片叶，接入柑橘雌成螨50 头，茎杆基部涂抹凡士林和爽身粉以防螨虫逃逸。4 h 后检查虫口基数，不足50 头的补足到50 头，然后进行喷雾处理。以喷至叶片正反面均匀布满雾滴、刚好滴水时为止。

药后1，3，5 d 调查盆栽植株上的活虫数，药后3、5 d 同时还调查所有叶片上的卵粒，以此计算防治效果和产卵抑制效果。

1.6 数据处理和分析

成螨、若螨、卵的活性测定采用死亡率和校正死亡率的公式进行计算：

产卵抑制作用采用如下产卵抑制率的公式进行计算：

盆栽防效采用虫口减退率和防效公式进行：

数据采用SPSS 20.0 软件进行处理，多重比较采用Turkey。毒力分析采用几率值进行线性回归，计算出致死中浓度及95%置信区间。

2 结果与分析

采用玻片浸渍法、喷雾法测定后，d-柠檬烯对柑橘全爪螨雌成螨、若螨和卵的毒力活性，以及对雌成螨的产卵抑制活性见表1。

表1 d-柠檬烯对柑橘全爪螨不同虫态的生物活性

从表1可以看出，d-柠檬烯对柑橘全爪螨的成螨、若螨和卵虽表现出一定的毒力活性，LC50值分别为541.07 mg/L、630.45 mg/L 和231.73 mg/L，但均在200 mg/L 以上，说明d-柠檬烯对柑橘全爪螨的触杀作用并不显著。同时，笔者在试验过程中也采用浸叶法进行了测定，发现在供试浓度下螨虫死亡率很低导致无法计算出LC50值（超过2 000 mg/L），表明d-柠檬烯对螨虫无明显的毒杀作用。

但是，喷雾法处理后，d-柠檬烯对柑橘全爪螨雌成螨的产卵表现出较明显的抑制活性，72 h 的产卵抑制作用中浓度为54.19 mg/L。相比于其他几种作用方式，d-柠檬烯的产卵抑制活性更为明显。

为弄清d-柠檬烯对柑橘全爪螨的综合防控作用，在室内活性测定基础上，以植物源成分鱼藤酮原药（96%）作为对照药剂，进一步通过盆栽试验研究了d-柠檬烯对柑橘全爪螨雌成螨的控制效果和产卵抑制作用。结果见表2。

表2 d-柠檬烯对柑橘全爪螨盆栽防效和产卵抑制作用

表2结果表明，d-柠檬烯喷雾处理后，对柑橘全爪螨雌成螨的1、3、5 d 防效分别为10.06%、15.04%和18.97%，均不超过20%，与鱼藤酮的防效之间存在显著差异，说明该化合物对成螨的防治效果较差，不会引起成螨快速死亡。而通过调查产卵数量发现，d-柠檬烯在盆栽试验中表现出了良好的产卵抑制作用，药后5 d 的产卵抑制率高达83.31%，明显优于对照药剂鱼藤酮，说明该药剂可明显地减少雌成螨在植株上的产卵量。

3 结论与讨论

对柑橘全爪螨不同虫态的毒力测定结果表明，喷雾或浸渍处理后，d-柠檬烯对螨虫的致死作用不明显，在实验中，课题组还测定了浸叶法的毒力，发现活性更低以致无法计算出LC50值，说明触杀和胃毒均不是这种精油成分的主要作用方式，与普遍认为的精油类成分能破坏昆虫体壁蜡质层或在昆虫体表形成油膜引起昆虫死亡的作用方式不同。

胡军华等[11]研究发现柑橘提取物对柑桔全爪螨具有较好的生物活性，并在GC-MS 确定组分的基础上测定了柠檬烯等4 种主要组分的毒力，结果表明柠檬烯对柑橘全爪螨雌成螨、若螨和卵的LC50值分别为59.2、230.1 和65.8 mg/L，与本文结果不一致，出现这种现象的原因可能与柠檬烯的构型和纯度不同有关。文献中采用的是dl构型（CAS 号为138-86-3），含量未述及，本研究采用的是d构型（CAS 号为5989-27-5），含量95%。

另外，Abdelgaleil 等[12]通过残毒法测定表明柠檬烯对赤拟谷盗24 h 触杀活性LC50值为494.18 μg/cm2、熏蒸活性LC50值为33.37 mg/L，袁海滨等[13]测定水蒿精油对绿豆象6 h 触杀活性LC50值为1.562 4 mg/L，活性大小差异很大，说明柠檬烯对不同试虫表现的作用方式不同，不同精油的主要作用方式也存在差异。

植物精油一般具有触杀、熏蒸、抑制产卵、驱避、拒食和引诱等多种活性[14-16]。本研究表明d-柠檬烯能抑制雌成螨产卵以及具有一定的杀卵作用，进而控制螨虫种群增长。但d-柠檬烯对柑橘全爪螨是否还有拒食等其他作用方式，以及是否能够减少成螨产卵的生物学机制还需进一步研究。

Oboh 等[17]发现桔皮主要成分d-柠檬烯对Na+/K+三磷酸酸腺苷的活性有抑制作用，Abdelgaleil 等[12]发现柠檬烯可抑制米象和赤拟谷盗的乙酰胆碱酯酶，也有报道指出植物精油可以破坏昆虫体壁蜡质层，破坏细胞和神经[18]或通过物理方式形成油膜的覆盖，引起昆虫窒息死亡[19]。d-柠檬烯是否也具有类似的作用机制，值得进一步探索。

总之，d-柠檬烯来源于植物，广谱、低毒，易降解，能很好地满足现代农产品安全生产的用药需要，必将有广阔的发展前景。