黄颡鱼消化道不同部位6种重要酶的分布和组织定位

王旭，程紫逸，曹新芳，任秋楠，王雪，张盛周

(安徽师范大学生命科学学院，安徽省重要生物资源保护与利用重点实验室，芜湖 241000)

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)俗称黄姑、黄鱼、黄腊丁，隶属鲶形目鲿科黄颡鱼属，是一种优质名贵的经济鱼类；其肉质鲜嫩味美、营养丰富，越来越受到消费者的青睐。

随着黄颡鱼的人工养殖的推广和养殖规模的不断扩大，对黄颡鱼人工养殖相关的基础生物学研究也在不断深入开展。Yang等[1]对黄颡鱼幼体消化道的个体发育进行了研究；Cao等[2]采用光镜和透射电镜对黄颡鱼消化道上皮粘液细胞超微结构和组化特征进行了观察分析；余涛等[3]对黄颡鱼消化器官蛋白酶和淀粉酶活性进行了生化测定分析。然而，黄颡鱼消化道黏膜中与消化吸收相关的关键酶的分布与组织定位尚未见报道。本研究利用冰冻切片、酶组织化学染色和光密度定量分析技术对黄颡鱼消化道不同部位酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、腺苷三磷酸酶(ATPase)、非特异性酯酶(NSE)、过氧化物酶(POX)和琥珀酸脱氢酶(SDH)等6种重要酶的分布与组织定位进行了研究，旨在增进对黄颡鱼消化机能的认识，为其人工养殖提供理论基础。

材料与方法

1 实验材料

人工养殖黄颡鱼12条，重200～500g，购买于芜湖市黄山西路的农贸市场。用解剖刀柄敲其后脑致晕，迅速解剖并取出完整消化道，于食道、胃贲门、胃体、胃幽门、前肠、中肠和后肠等7个部位分别取样，用磷酸缓冲液（PBS, pH7.4）快速漂洗后，对样品进行修整，继而使用OCT包埋。最后，在冰冻切片机（Leica CM1900）上切出约8μm的切片，置于 -20℃ 冰箱保存备用。

2 酶组织化学染色

黄颡鱼6种重要酶的组织化学染色方法和酶反应的主要底物见表1。其中，药品试剂的全称、配制方法、染色的具体操作步骤请参考谢毓玲等[4]的报道。

3 酶活力的光密度测定和数据统计分析

在Olympus BX61型显微镜下观察并拍照。使用Image-Pro Plus图像分析软件对选取的7个部位6种酶的清晰组织化学染色图片的阳性部位进行光密度分析，得到阳性部位的累积光密度(integrated optical density, IOD)和面积(Area)的准确值，算出平均光密度值(mean optical density, MOD)。每种酶每个部位测10个视野，取其平均值表示酶活力。使用数据分析软件SPSS 19.0，用单因素方差分析(one way ANOVA)对消化道不同部位酶的活力大小进行差异显著性比较，P＜0.05为差异显著。

表1 酶组织化学染色技术及6种酶的主要底物Tab. 1 Enzyme histochemical staining techniques and main substrates of the 6 enzymes

结 果

在光镜下，6种酶组织化学染色均呈现明显的颜色反应，染色结果经光密度测定和数据统计分析后，黄颡鱼消化道不同部位ACP、ALP、ATPase、NSE、POX和SDH 等酶的活力分布见表2。

1 酸性磷酸酶（ACP）的分布与定位

ACP的酶组织化学染色反应显示棕黄色。ACP在胃贲门、胃幽门和中肠酶活力显著较高，其次是前肠和后肠，在食道和胃体酶活力明显较弱。在食道中，ACP集中分布于固有层；在胃贲门和胃体中，ACP主要分布于固有层，粘膜上皮细胞和胃腺中亦有较多分布（图1A1）；在胃幽门中，ACP主要分布于固有层，粘膜上皮细胞中亦有少量分布；在肠道各部位，ACP均集中分布于黏膜上皮细胞顶部，固有层中有少量分布（图1A2）。

2 碱性磷酸酶（ALP）的分布与定位

ALP的酶组织化学染色反应显示蓝紫色。ALP在食道、前肠和后肠酶活力显著较高，其次是中肠，在胃贲门、胃体和胃幽门酶活力明显较弱。在食道中，ALP集中分布于固有层；在胃贲门和胃体中，ALP主要分布于黏膜上皮细胞，胃腺中亦有较多分布，在胃幽门中，ALP则集中分布于固有层；在肠道各部位，ALP 均集中分布于黏膜上皮细胞的纹状缘（图1B1）。

表2 黄颡鱼消化道黏膜6种重要酶的组织化学分布Tab. 2 Histochemical distribution of the 6 essential enzymes in the mucosa along the different parts of digestive tract of Pelteobagrus fulvidraco

3 三磷酸腺苷酶（ATPase）的分布与定位

ATPase的酶组织化学染色反应显示棕黑色。ATPase 在食道中酶活力显著较高，其次是胃贲门、胃体、胃幽门、前肠和后肠，在中肠酶活力明显较弱。在食道中，ATPase多分布于固有层，黏膜上皮细胞顶部有少量分布（图1C1）；在胃贲门和胃体中，ATPase 集中分布于胃腺（图1C2），在胃幽门中，ATPase则集中分布于粘膜上皮细胞；在肠道中，ATPase 均集中分布于黏膜上皮细胞的纹状缘。

4 非特异性酯酶（NSE）的分布与定位

NSE的酶组织化学染色反应显示棕红色。NSE在胃幽门酶活力显著较高，其次是食道和前肠，在胃贲门、胃体、中肠和后肠酶活力明显较弱。在食道中，NSE 多分布于黏膜上皮细胞的表层；在胃贲门和胃体中，NSE主要分布于胃腺，固有层中亦有较多分布（图1D1），在胃幽门中，NSE则集中分布于固有层；在肠道中，NSE主要分布于粘膜上皮细胞，其中粘膜上皮游离面明显较多（图1D2）。

5 过氧化物酶（POX）的分布与定位

POX的酶组织化学染色反应显示黄色或棕黄色，多呈颗粒状分布。POX在食道和胃幽门酶活力显著较高，其次是胃贲门、胃体、前肠和中肠，在后肠酶活力较弱。在食道中，POX多分布于黏膜上皮细胞基部（图1E1）；在胃贲门和胃体中，POX集中分布于粘膜上皮细胞，胃腺部有少量点状分布（图1E2），在胃幽门中，POX则集中分布于固有层；在肠道中，POX主要分布于黏膜上皮细胞，其中粘膜上皮细胞游离面明显较多。

6 琥珀酸脱氢酶（SDH）的分布与定位

SDH的酶组织化学染色反应显示蓝紫色。SDH在前肠酶活力显著较高，其次是胃贲门和胃体，在食道、胃幽门、中肠和后肠酶活力明显较弱。在食道中，SDH主要分布于粘膜上皮细胞基底部，上皮细胞顶部亦有少量分布（图1F1）；在胃贲门和胃体中，SDH集中分布于胃腺中（图1F2），在胃幽门中，SDH则集中分布于粘膜上皮细胞；在肠道中，SDH主要分布于黏膜上皮细胞顶部和基底部（图1F3）。

图1 6种重要酶在黄颡鱼消化道黏膜中的组织化学定位。A，ACP在胃体（A1）和中肠（A2）的分布；B，ALP在中肠（B1）的分布；C，ATPase 在食道（C1）胃体（C2）的分布；D，NSE在胃贲门（D1）和前肠（D2）的分布；E，POX在食道（E1）和胃贲门（E2）的分布；F，SDH在食道（F1）、胃体（F2）和前肠（F3）的分布；L:消化道腔；ME:粘膜上皮；CG:贲门腺； FG:胃底腺；LP:固有层；SB:纹状缘；比例尺=50μmFig. 1 Histochemical localization of 6 essential enzymes in the mucosa along the different parts of digestive tract of Pelteobagrus fulvidraco. A, location of ACP in the stomach corpus (A1) and middle intestine (A2)；B, location of ALP in the middle intestine (B1)；C, location of ATPase in the esophagus(C1) and stomach corpus (C2) ；D, location of NSE in the stomach cardia (D1) and anterior intestine (D2); E, location of POX in the esophagus(E1)and stomach cardia (E2)；F, location of SDH in the esophagus (F1) , stomach corpus (F2) and anterior intestine(F3)；L: lumen of the digestive tract;ME: mucosal epithelia; CG: cardia gland; FG: fundic gland; LP: lamina propria; SB: striated border; scale bar, 50μm

讨 论

ACP是一种在酸性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸的水解酶，其广泛分布于机体中，主要参与细胞的胞饮作用和细胞内的消化过程[5]。研究表明，鱼类消化道上皮细胞可通过胞饮作用直接消化吸收营养物质[6]。本研究显示，在黄颡鱼胃贲门、胃幽门和中肠ACP酶活力相对较高，食道和胃体酶活力较弱。与乌鳢(Ophiocephalus argus)[4]消化道ACP在中肠酶活力相对较高，食道酶活力较弱有一定的相似性；与鳜鱼(Siniperca chautsi)[7]消化道ACP在前肠酶活力较高，胃体酶活力相对较弱有所不同；与欧洲无须鳕 (Meluccius meluccius)[8]消化道ACP在食道、胃和肠道中都检测到很强的酶活力则明显不同。可见，ACP在鱼类消化道各部位的分布存在一定的物种及组织特异性。本研究表明黄颡鱼中肠是吸收蛋白质和细胞内消化的主要部位。有研究显示，ACP在细胞内核酸和蛋白质的代谢及细胞的能量转换过程中亦发挥重要作用[9]，故黄颡鱼胃贲门胃腺中有较高的ACP酶活力可能与其参与胃粘液和胃酸的分泌活动有关。

ALP是一种能够在碱性条件下将底物去磷酸化的非特异性磷酸水解酶，主要参与细胞膜的主动运输过程，在消化道中参与脂质、葡萄糖和钙离子等重要营养物质的吸收[10]，因此，常被看作是消化道吸收营养物质的一种标志性酶[11]。本研究显示，黄颡鱼食道、前肠和后肠ALP酶活力较高，而胃贲门、胃体和胃幽门酶活力相对较弱。与鳜鱼[7]消化道 ALP 在食道和前肠酶活力相对较高，胃贲门酶活力较弱有一定的相似性；与乌鳢[4]消化道ALP在肠道酶活力相对较高，胃贲门、胃体和胃幽门酶活力较弱相一致；与欧洲无须鳕[8]消化道 ALP在肠道酶活力相对较高，胃酶活力较弱亦相似。本研究表明黄颡鱼前肠和后肠是脂类、葡萄糖、钙和无机磷酸盐等重要营养物质吸收的主要部位。黄颡鱼前肠和后肠中ALP主要定位于黏膜上皮细胞的纹状缘，与其参与吸收营养物质的功能相适应。

ATPase 是一类能将ATP催化水解为ADP和磷酸根离子的水解酶，其普遍存在于细胞膜和细胞器膜上，主要通过水解ATP为物质的跨膜转运提供能量，参与肠道上皮细胞对营养物质的吸收过程[12,13]。本研究显示，黄颡鱼食道、胃和前肠ATPase酶活力较高，中肠酶活力相对较弱。与鳜鱼[7]消化道ATPase在食道酶活力相对较高，中肠酶活力较弱相一致；与乌鳢[4]消化道ATPase在胃中酶活力相对较高亦较相似。黄颡鱼食道ATPase酶活力较高可能与其捕食小鱼、小虾，以肉食性为主的食性有关，较高的ATPase酶活力有利于肌肉收缩和吞咽的进行。黄颡鱼胃中ATPase酶活力主要定位于胃腺，这种特异性的分布与胃酸和胃蛋白酶的分泌活动需要充足的能量有关；肠道中ATPase 主要定位于粘膜上皮细胞纹状缘，这与小肠参与营养物质吸收的功能相一致。

NSE是一种非特异性水解酯酶，在动物消化道中参与对酯类物质的消化与吸收[14]。鱼类的主要能量来源不是碳水化合物和蛋白质，而是脂类[8]。本研究显示，黄颡鱼胃幽门NSE酶活力相对较高，后肠酶活力较弱。与鳜鱼[7]消化道NSE在后肠和胃幽门酶活力相对较高存在差异；与尼罗罗非鱼(Oreoehromis niloticus)[10]消化道NSE均匀分布于整个肠道(除肠道末端外）不同；与大鳞红娘鱼(Lepidotrigla cavillone)[6]消化道NSE在后肠酶活力相对较高亦明显不同。可见，NSE在鱼类消化道各部位的分布存在明显的物种及组织特异性。本研究表明黄颡鱼胃幽门是酯酶分泌和脂质消化的主要部位。

POX是一种氧化还原酶，广泛存在于微生物、动植物体内，具有消除细胞内有毒代谢产物如过氧化氢、酚类、醛类、胺类等的功能[15,16]。此外，该酶还参与脂类代谢过程[17]。本研究显示，在黄颡鱼胃幽门中POX酶活力相对较高，后肠酶活力较弱。与乌鳢[4]消化道POX在胃体酶活力相对较高，胃幽门酶活力较弱明显不同；与胡子鲶（Clarias fuscus）[18]消化道POX在后肠和胃体酶活力都相对较高亦不相同；与鳜鱼[7]消化道POX在胃幽门酶活力相对较高相似，但与鳜鱼不同的是黄颡鱼食道中POX酶活力亦较高。POX在黄颡鱼胃幽门酶活力较高，可能与该部位代谢活动旺盛会产生较多代谢毒性物质有关。黄颡鱼POX 和NSE均以胃幽门中酶活力最高，这可能与POX亦参与脂质的代谢过程有关。

SDH属于细胞色素氧化酶类，是三羧酸(TCA)循环中唯一一个整合于膜上的多亚基酶，SDH的活性对TCA循环的速率有决定性作用[19]。本研究显示，在黄颡鱼胃体、胃贲门和前肠中SDH酶活力相对较高，中肠和后肠酶活力较弱。与乌鳢[4]消化道SDH在胃体和胃贲门酶活力较高相一致；与鳜鱼[7]消化道SDH在胃贲门酶活力相对较高亦相似。黄颡鱼胃中SDH酶活力主要定位于胃腺部，和胃中ATPase的组织定位相一致，两者均可为胃腺的分泌活动提供充足的能量。黄颡鱼前肠粘膜上皮细胞顶部亦有较多的SDH分布，这与上皮细胞通过主动运输吸收营养物质需要消耗较多能量相适应。

总之，黄颡鱼消化道黏膜 6 种重要酶的分布和其他鱼类既有相似性也有其物种特异性。黄颡鱼消化道6种重要酶的分布及其组织定位与消化道各部位执行的生理功能相适应，中肠是其吸收蛋白质和细胞内消化的主要部位；前肠和后肠是吸收脂类、葡萄糖、钙和无机磷酸盐等重要营养物质的主要部位；胃幽门是脂质消化的主要部位。