纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶及其代谢特性分析

刘璐(长春医学高等专科学校，吉林 长春 130031)

0 引言

随着人们生活水平的提高，食物的丰富程度与营养价值也越来越高，但心脑血管疾病的发生率也不断上升。纳豆菌在纳豆发酵过程中会产生一种丝氨酸蛋白酶，其学名被称为纳豆激酶，具有高效的溶血酸活性。纳豆激酶具有高效的溶血栓活性，可以降低心脑血管疾病的发生率，在越来越重视养生生活的今天，有极高的应用价值。以荞麦为发酵底物，通过纳豆菌液态发酵生产纳豆激酶在近年来成为主要趋势之一。这是由于荞麦的碳水化合物含量较高，且矿物元素、蛋白质、维生素以及膳食纤维的含量较高，适合纳豆菌的生长发育，且荞麦的成本较低，还含有较为多的芦丁等黄酮类化合物，生物活性较强且具备较好的抗氧化性，对于心脑血管疾病也具备较好的防治效果，与纳豆激酶可以共同作用，增强效能。因此，以荞麦为发酵底物通过纳豆菌液态发酵，不仅可以产生纳豆激酶而且可以有效提高发酵产物的抗氧化活性，该方法的发酵效率高。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：纳豆菌、荞麦、大豆分离蛋白、凝血酶、纤维蛋白原、BCA试剂盒、AAPH、荧光素、Trolox、大豆蛋白胨、胰酶、NS37071、复合蛋白酶、α-淀粉酶(10000U/g)、福林酚试剂。

仪器：VarioskanFlash型酶标仪、UV-721型紫外分光光度计、LRH-250A-Ⅱ生化培养箱、SKY-211B恒温培养振荡器、BioStatB2.5L发酵罐。

1.2 实验方法

1.2.1 瓶条件

种子培养基：蛋白胨1.5%、氯化钠1%、酵母粉0.5%，200mL/500mL锥形瓶，PH7.0。

种子液的制取：取试管中保存的纳豆菌在种子培养基中接种，保持温度37℃条件下，以转速为180r/min连续振荡培养20h。

荞麦糖化液培养基：浸泡荞麦6h以上，然后以1:10的料液比进行加水打浆，分为6组分别加入不同含量的α-淀粉酶，为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%，然后以90℃的温度同时加热40分钟，制取6组荞麦糖化液发酵培养基，并将pH调到7.0。

大豆分离蛋白酶解物：将大豆分离蛋白以1:15的料液比加去离子水，并充分搅拌，使大豆分离蛋白完全水化，分为3组，并分别加入大豆分离蛋白含量1.5%的胰酶、NS37071、复合蛋白酶，然后在55℃条件下，分别酶解4h、8h和12h，酶解完成后用沸水浴灭酶活性，最后在4℃条件下以8000r/min离心15min，取上清液经减压、浓缩、冷冻、干燥等流程制取大豆分离蛋白酶解物。

对比研究条件分别为α-淀粉酶添加量、补充氮源和发酵时间：

(1) α-淀粉酶添加量对比：取6组荞麦糖化液培养基分别接种2%的种子液，在温度为37℃的条件下，以180r/min连续振荡培养24h，对比研究α-淀粉酶添加量不同的情况下纳豆激酶生产率的情况。

(2)补充氮源的对比：去不同的大豆分离蛋白酶解物和商业蛋白胨，以4%的比例加入到荞麦糖化液培养基中，在温度为37℃、pH为7.0的条件下以180r/min连续振荡培养24h，对比研究补充氮源不同的情况下纳豆激酶生产率的情况。

(3)发酵时间：将大豆酶解物加入到荞麦糖化液培养基中，分为5组分别在温度为37℃、pH为7.0的条件下以180r/min连续振荡培养0h、12h、24h、36h、48h，对比研究不同发酵时间的情况下纳豆激酶生产率的情况。

1.2.2 发酵条件

发酵条件主要研究发酵罐通气量、转速、装液量、接种量等条件对纳豆菌液态发酵荞麦产纳豆激酶的影响。取上述制得的接种后的培养基，置入2.5L发酵罐中，在37℃条件下设置以下对比条件进行研究：(1)通气量对比实验分为3组，分别为2.0L/min、3.0L/min和4.0L/min；(2)转速对比实验分为3组，分别为200r/min、300r/min和400r/min；(3)装液量对比实验分为3组，分别为1L、1.5L和2L；(4)接种量对比实验分为3组，分别为2.0%、2.5%和3.0%。

1.2.3 发酵罐中菌体生长和代谢特性分析

在取得优化后的发酵条件下进行发酵，发酵过程中利用pH电极和复膜氧电极实时监测发酵罐中的pH值变化和氧含量变化，并且每隔8h取样分析，分别测定生物量、纳豆激酶活力、可溶性蛋白含量、还原糖含量、总酚含量、氧自由基吸收能力。

(1)生物量的测定：生物量测定主要采用细胞干重法，主要过程为取用20mL发酵液，在4℃条件下以8000r/min离心15min，收集离心后的物质，并使用生理盐水洗涤赶紧，然后在105℃条件下用干燥皿彻底烘干，最后称取重量，计算生物量。

(2)可溶性蛋白的测定：可溶性蛋白测定使用BCA试剂盒进行测定，标准选取牛血清蛋白浓度。

(3)还原糖的测定：还原糖测定使用DNS法进行测定，即3,5-二硝基水杨酸比色法。

1.3 数据处理

数据分析主要采用SPSS25.0软件，当P＜0.05为显著差异，表明研究结果具有对比价值。

2 结果与分析

2.1 摇瓶条件优化结果

(1)α-淀粉酶添加量的对比实验结果：生物体的生长和发育离不开碳水化合物，在纳豆菌的培养过程中，碳源的来源非常重要。不同的碳源生物体的利用率不同，菌体生长发育利用的碳源主要为麦芽糖或葡萄糖，在菌体生长发育中利用淀粉作为碳源时需要先将其水解水麦芽糖或者葡糖糖。α-淀粉酶可以快速的水解淀粉，将其水解为麦芽糖和麦芽三糖，然后进一步将麦芽三糖再水解为麦芽糖和葡萄糖。本文的实验结果也证明了这一点，添加有α-淀粉酶的荞麦糖化液其纳豆菌生产纳豆激酶的活力较高。因此，添加α-淀粉酶可以有效提高纳豆菌生产纳豆激酶的活力和产量，但是对比实验发现，添加有α-淀粉酶的荞麦糖化液培养基中，纳豆菌生产纳豆激酶的活力有明显的先升高后下降趋势，这一趋势在α-淀粉酶添加量为0.6%、0.8%、1%的荞麦糖化液培养基中随浓度的升高，变化趋势与变化速率越明显，而α-淀粉酶添加量为0.2%的荞麦糖化液培养基中，其纳豆菌生产纳豆激酶的活力升高趋势虽然比未添加α-淀粉酶的荞麦糖化培养基速率快，但是相比其他几组则速率较慢，而下降趋势则不明显，其中α-淀粉酶添加量为0.4%的荞麦糖化液培养基，纳豆菌生产纳豆激酶的活力不仅升高速度较快，且在之后保持了较为平稳的态势。造成这一现象的原因是，虽然葡萄糖是易吸收的速效碳源，但是当其含量过高时会产生阻遏作用，影响纳豆菌生产纳豆激酶的活力，而在α-淀粉酶添加量为0.4%的荞麦糖化液培养基中，α-淀粉酶分解淀粉的速率适中，可以供纳豆菌较好的利用，因此其可以有效提高纳豆菌生产纳豆激酶的活力。通过对比实验发现，α-淀粉酶添加量为0.4%时纳豆菌生产纳豆激酶的活性最高。

(2)补充氮源对比实验结果：纳豆菌在使用大豆蛋白胨作为氮源时进行发酵生产纳豆激酶的活性较高，这是基于其选着性决定的。在利用其它氮源时纳豆菌可以正常生长但是生产纳豆激酶的活性较低。大豆蛋白胨是由大豆蛋白水解后形成的一种肽类和氨基酸形成的混合物，可利用程度较高，可以有效提高纳豆菌的吸收速率和纳豆激酶的生产活性。但是大豆蛋白胨的价格较高，且缺少安全性的食品级蛋白胨。

(3)发酵时间对比实验结果：发酵时间可以影响纳豆激酶的生产活力，在发酵过程中，随着发酵时间的延长，纳豆激酶的生产活性会不断提高，但是当其到达峰值后，如果继续发酵则会限制酶活性，造成酶活性下降。这是由于纳豆激酶产量到达峰值后，如果继续发酵，则会造成纳豆菌种群含量过高，而由于空间不足，从而造成能量消耗过大，影响纳豆激酶的生产活力。通过对比实验发现，发酵时间为36h时，纳豆激酶的产率到达峰值，之后会随着发酵时间的延长，纳豆激酶的产率逐渐降低，因此36h为最为合理的发酵时间。

2.2 发酵罐发酵条件优化结果

纳豆菌是典型的好氧细菌，较高的氧含量有助于提高纳豆激酶的活性，实验结果如下：

(1)通气量的提高可以增加发酵罐中的氧含量，通气量较低时，纳豆激酶的活性较低；而通气量较高时，纳豆激酶的活性较高，但会导致发酵罐起泡。对比研究发现通气量为3.0L/min时，可以较好的兼顾酶活性与气泡程度；

(2)搅拌速度也可以提高发酵罐中的溶氧量，提高纳豆激酶的生产活性，但是搅拌速度过高会伤害纳豆菌群，造成菌体发育速度下降。对比实验发现搅拌速度为300r/min时可以较好的提高纳豆激酶的生产活性同时保证纳豆菌群的发育；

(3)装液量过高或过低都不利于纳豆菌群的发育，这是由于装液量过低生产原料不足，而装液量过高，空间过小会影响溶氧量，对比研究发现装液量为1.5L时较为理想；

(4)接种量决定了纳豆菌群的发育速度，接种量过低则纳豆菌群的发育速度较慢，难以及时进行生产，而接种量过高则会导致纳豆菌群的发育速度过快，造成资源消耗过快，有害物质的积累过快。通过对比实验发现，接种量为2.5%时，纳豆菌群的发育情况较为理想，纳豆激酶的生产活力较高。

2.3 发酵罐中菌体生长和代谢特性分析

通过前文的分析可知，在摇瓶条件下，商业大豆蛋白胨与NS37071-12h制取的大豆蛋白酶解物生产纳豆激酶的活力没有明显的差异。但是由于两者的水解度、混合物组成以及分子情况均有所差异，在发酵罐中放大培养时，两者可能会出现差异，以下对此进行分析：

(1)氮源对生物量影响：两者进行添加后均没有明显的延滞期。商业蛋白胨的整体生物量增长较快，24h达到最大生物量5.81g/L。大豆分离蛋白酶解物的整体生物量较前者慢，但是对数期较长，30h达到最大生物量6.68g/L。相比而言，虽然商业蛋白胨的生物量增长更快，但是后期增长率不足，生物量总体上较大豆分离蛋白酶解物的含量更低。

(2)氮源对还原糖的影响：实验结果证明，商业蛋白胨前期的还原糖消耗较快，但是24h基本停止，而大豆分离蛋白酶解物的前期还原糖含量消耗较慢，但是直到36h后还原糖消耗才逐渐停止，证明了纳豆菌群的增长与还原糖的消耗成一定的关系。

3 结语

本文对以荞麦为发酵底物，通过纳豆菌液态发酵生产纳豆激酶，并对其进行优化研究，分析其代谢特性。通过对比实验发现，纳豆菌群的增长与还原糖的消耗成一定的关系，36h为最为合理的发酵时间。接种量为2.5%时，纳豆菌群的发育情况较为理想，纳豆激酶的生产活力较高。