α-亚麻酸通过提高GSH 水平、降低ROS 水平促进绵羊卵母细胞抗氧化与氧化平衡能力

张 博，宋玉坤，努日比娅姆•麦麦提托合提，阿尔曼•海热，赵 茜，阿布力孜•吾斯曼

（新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

卵母细胞体外成熟（IVM）培养时要完成胞质成熟，体外受精（IVF）才能成功，早期胚胎才能正常发育。IVM 过程中卵母细胞细胞质内部会经历一系列生理生化过程，通常采用如三磷酸腺苷（ATP）、谷胱甘肽（GSH）、活性氧（ROS）、Ca2+等生化指标对卵母细胞发育能力进行准确、客观的评价。在胚胎体外生产（IVP）过程中，特别在20% O2下，会产生许多对卵母细胞成熟[1]和胚胎发育有害的ROS[2]。高水平ROS 会诱导氧化应激导致卵母细胞线粒体内膜电位的降低、纺锤体的破坏和细胞质ATP 水平的降低[3]。胚胎细胞中ROS水平的增加可导致胚胎发育缺陷和胚胎停滞[4]。GSH 是哺乳动物体内一种重要的非蛋白巯基三肽，为了防止过多ROS 引起氧化损伤，许多哺乳动物卵母细胞成熟过程中会合成GSH。GSH 含量会随着成熟时间而逐渐积累，到第2 次减数分裂中期（M Ⅱ期）时GSH 含量最高[5-6]。此时高水平的GSH 代表高质量的胞质成熟，因为高水平的GSH 可以使卵母细胞免受ROS 的氧化损伤[7]、促进雄原核形成[5]、促进胚胎发育[8]。综上，卵母细胞内GSH、ROS 的水平反映细胞质成熟的程度，可作为胞质质量特征性指标。ALA 常温下性状为淡黄色油状液体，高度不饱和，它存在于种子油、豆类、核桃和叶类蔬菜中。ALA 是哺乳动物2 种必需脂肪酸之一，也是生物体组织生物膜的结构材料。因此，本实验旨在研究绵羊卵母细胞IVM 培养基中添加100 μmol/L ALA[9]对成熟后胞质GSH、ROS 水平的影响，探究ALA 对改善卵母细胞胞质质量的作用效果。

1 材料与方法

1.1 材料药品 促卵泡素（FSH）、促黄体素（LH）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、肝素钠、透明质酸酶、无脂肪酸牛血清白蛋白（FA-BSA）购自Solarbio 公司，其余药品均购自美国Sigma 公司。绵羊卵巢采自乌鲁木齐草绿天蓝畜牧公司华凌屠宰场。

1.2 试剂配制 卵巢保存液：0.9%生理盐水+8 mmol/L葡萄糖+0.2 g/L MgCl2+0.2 g/L CaCl2+100 mg/L 青霉素+100 mg/L 链霉素。

采卵液：9.5 g/L TCM199 +5 mmol/L NaHCO3+10 mmol/L HEPES+10 mmol/L HEPES-Na+2 500 U/L 肝素钠+4 g/L BSA +0.01 g/L 酚红+100 mg/L 青霉素+100 mg/L 链霉素。

卵母细胞基础成熟液：9.5 g/L TCM199+6 g/L BSA+25 mmol/L NaHCO3+500 U/L FSH+500 U/L LH+1 mg/L E2+25 μg/L EGF+5 μg/L VEGF+1.5 mmol/L 葡萄糖+5.5 mmol/L 乳酸钠+2 mmol/L 丙酮酸钠+1 mmol/L 谷氨酰胺+0.1 mmol/L 半胱氨酸+100 mg/L 青霉素+100 mg/L链霉素。

100 μmol/L ALA 卵母细胞成熟液：卵母细胞基础成熟液中添加100 μmol/L ALA。

0.1%透明质酸酶：1 g/L 透明质酸酶＋9.5 g/L TCM 199+2.1 g/L NaHCO3。

DPBS：8 g/L NaCl +0.2 g/L KCl+0.05 g/L KH2PO4+2.17 g/L Na2HPO4•7H2O+0.13 g/L CaCl2•2H2O+0.1 g/L MgCl2•6H2O。

Tyrodes medium（TLH）：8 g/L NaCl+0.2 g/L KCl+0.2 g/L CaCl2•2H2O +0.1 g/L MgCl2•6H2O+0.05 g/L NaH2PO4+1 g/L NaHCO3+1 g/L 葡糖糖。

0.1%DPBS-PVA：1 g 聚乙烯醇（PVA）热溶于1 L DPBS 中。

0.1%TLH-PVA：1 g PVA 热溶于1 L TLH 中。

H2DCFDA 母液：4.87 mg H2DCFDA 溶于1 mL DMSO中，配成10 mmol/L 母液。

CMF2HC 母液：2.47 mg CMF2HC 溶于1 mL DMSO中，配成10 mmol/L 母液。

10 μmol/L H2DCFDA 工作液：1 μL H2DCFDA 母液溶于1 mL TLH-PVA 中，现配现用。

10 μmol/L CMF2HC 工作液：1 μL CMF2HC 母液溶于1 mL TLH-PVA 中，现配现用。

1.3 实验方法

1.3.1 离体卵巢收集 绵羊被屠宰后30 min 内将卵巢无菌采集，放置于20～25℃的卵巢保存液中，2～4 h 内带回实验室。为防止卵巢被污染，浸泡卵巢的生理盐水中应加入青霉素、链霉素。

1.3.2 卵母细胞采集 采用抽吸法进行卵母细胞收集。用带有21 G 针头的10 mL 注射器在卵巢上抽吸2～6 mm卵泡并在抽吸前吸取2 mL 采卵液，从而将卵母细胞吸出流入采卵液。

1.3.3 卵母细胞选择 将采卵液注入培养皿，在体视显微镜下检出带有卵丘细胞的卵子，通常选择A、B 级卵母细胞进行成熟培养。A 级卵母细胞要求有3 层以上卵丘细胞紧密包围，而且A 级的卵丘细胞扩张充分；B 级要求卵母细胞质均匀，卵丘细胞低于3 层或部分包围卵母细胞。

1.3.4 卵母细胞的成熟培养 培养温度为38.5℃时卵母细胞的成熟率最高，体外培养时间以24 h 为宜。二氧化碳培养箱中培养卵母细胞，气相环境：5%CO2、95%空气、100%湿度。

1.3.5 测定细胞内GSH 和ROS 水平 卵母细胞裸露处理：每个处理组含8～15 个COCs 用0.1% 透酶处理去除卵丘细胞，0.1%DPBS-PVA 洗涤3 次。通过H2DCFDA/CMF2HC 荧光染料测定细胞内ROS/GSH 水平。将裸露的卵母细胞在含有10 μmol/L H2DCFDA/CMF2HC 的TLH-PVA 中（37℃、5%CO2、95%空气、100% 湿度二氧化碳培养箱）孵育30min。0.1%DPBSPVA 洗涤3 次，置于10 μL DPBS 液滴中，在装有蓝光/紫外线滤光片的荧光倒置显微镜上观察荧光。记录绿色/蓝色荧光图像作为TIFF 格式文件，通过Image J 软件分析卵母细胞的荧光强度。

1.4 实验设计

1.4.1 添加100 μmol/L ALA 对IVM 绵羊卵母细胞胞质ROS 水平的影响 使用含ALA（0、100 μmol/L）的IVM 培养基孵育绵羊卵母细胞24 h，透酶去除颗粒细胞后，H2DCFDA 进行胞质ROS 染色，Image J 软件统计分析并归一化至对照组卵母细胞。将COCs 随机分配到每个组中，实验4 次重复。

1.4.2 添加100 μmol/L ALA 对IVM 绵羊卵母细胞胞质GSH 水平的影响 使用含ALA（0、100 μmol/L）的IVM 培养基孵育绵羊卵母细胞24 h，透酶去除颗粒细胞后，CMF2HC 进行胞质GSH 染色，Image J 软件统计分析并归一化至对照组卵母细胞。将COCs 随机分配到每个组中，实验4 次重复。

1.5 统计分析 使用SPSS21.0 进行数据处理，多组比较满足正态性和方差齐性的采用单因素方差分析，以平均值± 标准差表示数据。显著性检验水准α=0.05，极显著性检验水准α=0.01。

2 结果

2.1 添加100 μmol/L ALA 对IVM 绵羊卵母细胞胞质GSH 水平影响 如表1 和图1 所示，相较0 μmol/L 组，添加100 μmol/L ALA 可显著提高绵羊卵母细胞细胞质GSH 水平，即可以显著增强IVM 绵羊卵母细胞的抗氧化能力。

表1 100 μmol/L ALA 对IVM 后绵羊卵母细胞质内GSH 的影响（n=4）

2.2 添加100 μmol/L ALA 对IVM 绵羊卵母细胞胞质ROS 水平的影响 如表2 和图2 所示，相较0 μmol/L 组，添加100 μmol/L ALA 可极显著降低绵羊卵母细胞细胞质ROS 水平，即可以显著改善IVM 绵羊卵母细胞氧化还原状态。

3 讨 论

本实验结果显示，添加100 μmol/L ALA 可显著提高绵羊卵母细胞细胞质GSH 水平，这与Lee 等[10]研究添加100 μmol/L ALA 显著增加猪卵母细胞内GSH水平的结果一致。但Veshkini 等[11]研究显示，添加50 μmol/L ALA 对山羊卵母细胞内GSH 水平无显著影响，可能在于山羊卵泡液的ALA 生理浓度范围为64.6～100.6 μmol/L[11]，而实验中ALA 添加水平偏低。添加ALA 提高IVM 后卵母细胞细胞质GSH 水平的可能作用途径尚未见报道。本研究推测可能是添加ALA促进GSH 的合成和/ 或减缓GSH 的消耗提高了IVM后卵母细胞细胞质GSH 水平。半胱氨酸作为GSH 合成的限速底物[12]，通过在含有100 μmol/L ALA 的成熟培养基中添加不同浓度的半胱氨酸或者胱氨酸来验证ALA 是否通过半胱氨酸途径促进GSH 合成；γ谷氨酰半胱氨酸合成酶是GSH 合成的限速酶，通过在含有100 μmol/L ALA 的成熟培养基中添加或者不添加丁硫氨酸磺酰亚胺（γ谷氨酰半胱氨酸合成酶的特异性抑制剂）来验证ALA 是否通过限速酶途径促进GSH 合成。卵母细胞IVM 22 h 时在含有100 μmol/L ALA 的成熟培养基中添加或者不添加H2O2并接着培养2 h，通过测定24 h 时GSH 水平推测ALA 是否通过减缓GSH 的消耗从而提高IVM 后卵母细胞细胞质GSH 水平[13]。

表2 100 μmol/L ALA 对IVM 后绵羊卵母细胞质内ROS 的影响（n=4）

本实验结果显示，添加100 μmol/L ALA 可极显著降低绵羊卵母细胞细胞质ROS 水平，与添加50 μmol/L ALA 显著降低牛[14]、水牛[15]卵母细胞内ROS 水平的结论一致。Wfa 等[15]在水牛卵母细胞IVM 基础培养基中也添加了100 μmol/L 半胱胺，半胱胺作为GSH合成底物促进ROS 水平降低，这可能是造成ALA 降低ROS 水平不显著的原因。Cetica 等[16]认为在牛卵母细胞中酶促抗氧化系统在IVM 期间调节ROS 水平，SOD、GSH-Px 和CAT 活性的上升能够控制ROS 的积累。Corrêa 等[17]研究表明，牛胚胎中SOD、GSH-Px和CAT 基因表达的上升能够改善高氧环境造成的胚胎质量不佳。为了确认ALA 降低IVM 24 h 后卵母细胞细胞质ROS 水平是否通过抗氧化酶活性的增加和/ 或者抗氧化酶基因表达的上升，需要做进一步验证。

4 结 论

本实验证明，绵羊卵母细胞成熟培养基中添加100 μmol/L ALA 可以显著改善IVM 后卵母细胞氧化平衡状态、显著增强卵母细胞抗氧化能力。