抗菌肽B-13 对初生仔猪生长性能、小肠结构及盲肠微生物的影响

梁秀丽 ，马发顺，韩方方，连凯琪，王世琼，魏战勇*，张文举

（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000；2.安阳工学院生物与食品工程学院，河南安阳 455000；河南农业大学牧医学院，河南郑州 450000）

抗菌肽（Antibacterial peptides，ABPs）又称抗微生物肽（Antimicrobialpeptides，AMPs）或肽抗生素（Peptideantibiotics），是生物机体在抵御病原微生物的防御反应（Defense Response）过程中所产生的一类抗微生物的短肽（Antimicrobialand Malignant Small Peptides），与干扰素、补体等组成了宿主的免疫防御系统[1]。抗菌肽对绝大多数的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有显著的抗菌作用[2-4]，对病毒[5]、真菌[6]、寄生虫[7]也有一定的杀伤作用，此外还有调节免疫功能[8]及抑制或杀伤肿瘤细胞[9]等作用。抗菌肽具有分子量小、水溶性好、耐热、无免疫原性等特点。近几年由于抗生素的一系列副作用和人们对食品安全的高要求，迫切需要抗生素替代物，因此抗菌肽正逐步地应用于畜牧业生产。抗菌肽在仔猪生产上的应用较多[10]。麻延峰等[11]研究表明，与对照组和抗生素组相比，日粮中添加抗菌肽制剂可显著提高仔猪平均日增重，降低腹泻率；刘丁健等[12]在基础日粮中添加抗菌肽显著提高了仔猪生产性能和健康水平；李方方等[13]和肖发沂等[14]在断奶仔猪日粮中添加抗菌肽均提高了仔猪的生长性能和免疫力。目前的研究多集中在抗菌肽对断奶仔猪的影响，对初生仔猪研究较少，且很少有病毒感染方面的研究。本试验研究以初生仔猪为试验动物，在攻毒和未攻毒情况下观察抗菌肽B-13（APB-13）对其生产性能及小肠形态发育、盲肠微生物的影响，为抗菌肽更为广泛地应用于仔猪生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 抗菌肽、基础日粮及病毒 APB-13 为来源于牛源抗菌肽序列（ILPWKWPWWPWRR），分子量为1.6 ku，由上海吉尔生化有限公司合成，纯度98%。初生仔猪基础日粮为北京爱地科技有限公司生产的代乳粉，其营养成分见表1。猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）由河南农业大学魏战勇教授惠赠。

表1 仔猪基础日粮营养成分

1.2 试验设计 试验用初生4 d、体重约1.6 kg 的杜洛克×长白×大白健康仔猪36 头，公、母各半，购于河南安阳某种猪场。将仔猪随机分为4 处理组，每组3 个重复，每个重复3 头仔猪。对照组饲喂基础日粮不加肽不攻毒，TGEV 组饲喂基础日粮不加肽TGEV 攻毒，APB-13 组饲喂基础日粮+10 g/kg BW 抗菌肽不攻毒，APB-13+TGEV 组饲喂基础日粮+10 g/kg BW 抗菌肽并TGEV 攻毒。TGEV 组和APB-13+TGEV 组攻毒时间为仔猪出生第6 天20:00，TGEV（TCID50=108）攻毒量是10 mL/头。攻毒后观察4 d 屠宰。

1.3 饲养管理 按照仔猪常规饲养管理方法进行，从购买仔猪开始饲喂代乳粉和APB-13，用40～50℃温水按6 L/kg 比例稀释代乳粉，APB-13 按照10 g/kg BW 添加到代乳粉中。每3 h 喂1 次代乳粉，每2 h 喂1 次温水。对照组和APB-13 组、TGEV 组、APB-13+TGEV 组分别在不同的实验动物房，每个重复3 头仔猪1 个猪栏，由2 位专职人员分别管理以防止病原传染。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能 以重复为单位记录仔猪每天的投料量和余料量，计算平均日采食量（ADFI）。仔猪出生第4、7、11 天08:00 称量体重，以重复为单位计算仔猪平均日增重（ADG）。根据试验期内的总耗料量和总增重计算耗料增重比（F/G）。试验期内每天观察和记录仔猪腹泻情况，根据腹泻头数和观察总头数计算腹泻率。

1.4.2 肠道组织形态 试验结束后，每组选择3 头有代表性的仔猪屠宰，取十二指肠、空肠、回肠肠段保存于4%甲醛溶液中固定。随后将固定的十二指肠、空肠、回肠组织经过切块、冲水、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、制片、HE 染色等一系列处理后，在显微镜下观察小肠黏膜结构，选择典型视野拍摄图片，用Lei-ca Qwin 图像分析系统测量绒毛高度（VH，绒毛顶端到根部的垂直高度）和隐窝深度（CD，绒毛根部至基底层的距离），并计算绒毛高度/隐窝深度（V/C）。每个样品做3 张不连续切片，每张切片选取5 根完整的绒毛。

1.4.3 肠道微生物 屠宰仔猪时将各肠段结扎，防止肠内容物相互移动，速取盲肠中段内容物保存于-80℃冰箱，以干冰包裹（每组3 个样本）送专业生物公司进行16S rRNA 高通量测序检测盲肠微生物的α 多样性、菌群属水平和分类模型。微生物群落α 多样性指数代表不同的含义，Chao1 和ACE 都是微生物菌群丰富度估计指数，Chao1 通过计算群落中只检测到1 次和2 次的OUT 数估计群落中实际存在的物种数，ACE 通过默认序列量10 以下的OUT 估计群落中实际存在的物种数；Shannon 和Simpson 都是菌群多样性指数，指数越高表明群落的多样性越高，Shannon 对群落的丰富度和稀有OUT 更敏感，而Simpson 指数对均匀度和群落中的优势OUT 更敏感。

1.5 统计分析 试验数据用Excel 初步处理，再用SPSS 17.0 软件进行方差分析和Duncan´s 多重比较，包括加肽、攻毒及互作效应3 个因素。除F/G 和腹泻率外，结果以平均值± 标准误表示。P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。

2 结果

2.1 APB-13 对初生仔猪生长性能和腹泻率的影响 由表2 可知，添加APB-13 能极显著提高仔猪ADG，而对仔猪ADFI 指标无显著影响，攻毒可极显著降低仔猪的ADFI 和ADG，而是否加肽与是否攻毒间互作效应不显著。从F/G 和腹泻率来看，加肽组均低于不加肽组，攻毒组均高于未攻毒组。

2.2 APB-13 对初生仔猪小肠形态的影响 由表3 可知，添加抗菌肽可极显著提高十二指肠和空肠的VH，而对回肠的VH 无显著影响。攻毒极显著降低了十二指肠和空肠的VH，而对回肠VH 无显著影响。是否加肽与攻毒仅对十二指肠的VH 存在互作（P＜0.05），对空肠和回肠的VH 均不存在互作效应。添加抗菌肽可极显著降低十二指肠和空肠的CD，而对回肠的CD 无显著影响。攻毒极显著提高了十二指肠、空肠及回肠的CD。是否加肽与攻毒仅对十二指肠的CD 存在互作效应（P＜0.01）。添加抗菌肽可极显著提高空肠V/C，而对十二指肠和回肠的V/C 无显著影响。攻毒极显著提高了十二指肠和空肠V/C，而对回肠V/C 无显著影响。是否加肽与攻毒在十二指肠和空肠对V/C 存在互作效应（P＜0.01），对回肠无影响。小肠CD 越低，V/C 越大则小肠形态发育越好。

由图1 可知，APB-13 可改善初生仔猪小肠形态发育，特别是对空肠影响最明显。加肽处理组的肠绒毛相对长，浓密且结构完整，攻毒组的肠绒毛较短，且脱落、断裂较严重，小肠基底组织受损明显。

2.3 APB-13 对初生仔猪盲肠微生物的影响 仔猪盲肠微生物多样性测定结果如表4。从Chao1 和ACE 2 种指数来看，无论在攻毒还是在未攻毒情况下，加肽组均低于未加肽组（P＞0.05），说明饲料中添加APB-13 降低了盲肠微生物菌群丰富度，且攻毒和加肽与否之间没有互作效应。从Simpson 指数来看，未攻毒情况下无差异，攻毒组中加肽组低于不加肽组（P＞0.05），且攻毒和加肽与否之间有显著互作效应，说明肽×毒互作显著降低了微生物菌群多样性。从Shannon 指数来看，在未攻毒情况下，加肽组高于不加肽组，攻毒情况下，加肽组低于不加肽组（P＞0.05），而攻毒与加肽与否之间有显著互作效应，说明肽×毒互作显著降低了微生物菌群多样性。

表2 APB-13 对初生仔猪生长性能和腹泻率的影响

表3 APB-13 对初生仔猪小肠形态的影响

表4 仔猪盲肠微生物α 多样性指数

仔猪盲肠微生物菌群差异可以通过PCoA 分析进行分类，PC1 和PC2 分别为33.38%和24.37%。从图2 可知，对照组和APB-13 组均能各自聚类，TGEV 组和APB-13+TGEV 组相对较分散，说明APB-13 对未攻毒和攻毒的仔猪盲肠微生物菌落结构都有调控作用。APB-13+TGEV组较TGEV 组更聚集一些，说明在TGEV 感染时APB-13 调控作用更明显。

从图3 可以看出，添加APB-13 后，仔猪盲肠微生物中优势菌群为乳酸菌属、瘤胃菌属和拟杆菌属，劣势菌群为柯林斯菌属、普氏菌属和链球菌属。说明APB-13 的添加抑制了柯林斯菌属、普氏菌属和链球菌属增殖，其中对柯林斯菌属和普氏菌属抑制作用较明显，同时促进了乳酸菌属、瘤胃菌属和拟杆菌属增殖，特别是对动物有益的乳酸菌属增殖。

3 讨 论

3.1 抗菌肽B-13 显著改善初生仔猪生长性能、降低腹泻率 初生仔猪比断奶仔猪体质更脆弱，因此更容易出现生长缓慢、生长性能下降及腹泻等。为此，在饲料中添加益生菌、合生元、中草药、酶制剂等已经有许多研究。研究表明，抗菌肽能被快速吸收，提高种群存活率[15]；同时日粮中添加抗菌肽可提高仔猪日采食量和极显著降低腹泻率[16-17]；于宝君[18]研究表明，微生态制剂能促进猪体健康和生产性能；卜艳玲等[19]研究饲粮中添加肠杆菌肽也提高了仔猪生长性能和血清生化指标。特别是在仔猪受病原微生物感染时，抗菌肽更能发挥其功能。Liu 等[20]研究表明，大肠杆菌感染下，添加抗菌肽KR-32 可使断奶仔猪ADG 和表观总肠道消化率（ATTD）恢复原有水平。本试验中，APB-13 的添加极显著提高了ADG，明显降低腹泻率，在TGEV 感染时也充分发挥了促生长和抗病作用。

3.2 APB-13 促进仔猪小肠结构发育 小肠是仔猪营养吸收的最主要部位，空肠占小肠比例最大，通常空肠长度约是十二指肠和回肠之和的9 倍，因此空肠形态结构发育直接关系到营养物质吸收和抗病能力。仔猪腹泻病的靶部位主要是肠道。Xia 等[21]研究中TGEV 感染的仔猪小肠绒毛短、粗、断裂等，损伤严重，与本研究相似。如何修复肠道损伤和促进肠道形态发育已有较多研究。肖昊等[22]研究表明，复合抗菌肽对呕吐毒素诱导仔猪肠道损伤有修复作用；宦海琳等[23]研究表明，饲料中添加抗菌肽能提高仔猪VH 和降低CD；刘莉如等[24]研究表明，仔公鸡饲料中添加天蚕素抗菌肽组空肠VH较对照组提高了24.08%；李平等[25]研究表明，饲料中添加抗菌肽能显著降低V/C，随抗菌肽添加量的增加其VH 也逐渐增加；Wu 等[26]研究表明，饲料中添加天蚕素AD 能增加仔猪空肠和回肠的V/C、空肠CD 及回肠VH。本试验中，未攻毒组添加APB-13 可使空肠的VH和V/C 显著升高，CD 显著降低；攻毒组添加抗菌肽可使空肠的VH 和V/C 极显著升高，CD 极显著降低。此研究结果与前人研究结果相吻合。这表明APB-13 的添加在仔猪无病状态下能显著促进空肠形态发育，在TGEV 感染下能极显著缓解和改善空肠形态结构，降低TGEV 对肠道的损伤，增强仔猪抗病能力。

3.3 APB-13 改善仔猪盲肠微生物菌群 仔猪肠道微生物菌群与仔猪生长及抗病能力，特别是仔猪腹泻病有密切联系。通常对仔猪肠道有益菌研究最多的是乳酸杆菌、双歧杆菌及类球菌等，有害菌多是肠杆菌、葡萄球菌及链球菌的研究。张文俊等[27]研究表明，仔猪在8～22 日龄时，拟杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌及消化球菌等为优势菌群。Tang 等[28]研究表明，日粮中添加融合抗菌肽可增加乳酸杆菌和双歧杆菌浓度，降低易引发腹泻病的大肠杆菌浓度；陈张华等[29]研究表明，仔猪料中添加复合抗菌肽可极显著增加乳酸菌量和降低大肠杆菌量；饲料中添加天蚕素和猪源PR39 抗菌肽可改善肠道微生物菌群，促进仔猪消化和保障仔猪健康[30]。本试验中添加APB-13 提高了乳酸菌属、瘤胃菌属及拟杆菌属的数量，降低了产气的柯林斯菌属、链球菌及普氏菌属量。这与前人研究结果一致，都是通过增加有益菌减少有害菌来调控或改善微生物区系。因此，推测仔猪生长性能提高和腹泻率降低与猪肠道发育及其微生物的影响密不可分，具体的作用机制仍需开展更多研究。

3.4 动物在病毒感染情况下抗菌肽对肠道微生物的改善更为明显 很多研究表明，抗菌肽通过改善肠道微生物从而促进猪体健康，但并没有对动物在病原微生物感染情况下开展研究。生产实践中，仔猪很容易发生腹泻病，尤其是猪传染性胃肠炎，其感染率和致死率分别达到30%和100%[31]。因此，为验证APB-13 在TGEV 感染情况下对仔猪的影响，本试验中同时对未攻毒组和攻毒组APB-13 的作用进行研究，并获得基本一致的结果。本试验中TGEV 组和APB-13+TGEV 组微生物菌群多样性指数Shannon 差异极显著，PCoA 分析结果也表明，在TGEV 感染情况下APB-13 对仔猪盲肠微生物向健康区系调控作用更显著，从而促进猪体健康。

4 结 论

本研究结果表明，APB-13 能提高初生仔猪的生长性能，降低其腹泻率，显著改善初生仔猪小肠形态发育，对空肠形态发育影响最明显；APB-13 能调节盲肠微生物菌群多样性和丰富度，增加有益菌增殖，减少有害菌增殖；在TGEV 感染情况下，APB-13 能提高ADG，大大降低腹泻率，并极显著地改善空肠形态发育，调控盲肠微生物健康区系。