代乳粉添加女贞子对羔羊生长性能、免疫和抗氧化功能的影响

乔国华 ，索朗达，吴玉江，德 吉，巴 贵，次仁德吉，解铁民，肖志刚，陈兴月

（1.沈阳师范大学粮食学院，辽宁沈阳 110034；2.西藏自治区农牧科学院畜牧研究所，西藏拉萨 850000）

湖羊是中国代表性绵羊品种，产羔率在200%以上，一胎多羔。母乳通常可以喂养1～2 羔，其他1～2 羔将死于饥饿[1]，因此实际生产中多采用人工饲喂以免于羔羊死亡。人工饲喂羔羊常用牛乳或重新调配的代乳粉，但由于其乳糖含量较高（35%～39%），羔羊死于真胃臌气的比例超过5%[2]。研究证明，羊乳与牛乳的成分差别很大，羊乳粉的乳糖含量（一般为25%）比牛乳低，乳脂肪比牛乳高（32% vs 28%），乳蛋白比牛乳高（30%vs 26%）[3-6]。初生羔羊非常容易受到很多环境因素影响，如低温和病原微生物。为抵抗这些病原微生物，土霉素等抗生素被广泛用做饲料药物添加剂，但使用抗生素产生耐药菌株等问题引发关注，无抗饲养成为大势所趋。中草药作为绿色饲料添加剂，在牛、羊、猪、鸡的养殖上得到广泛应用。早期研究证明，女贞子有改善育成期奶牛免疫状态的作用，可提高血浆中免疫球蛋白G和免疫球蛋白E[7]。添加女贞子也能够提高绵羊血液抗氧化功能[8]。本试验旨在研究羔羊奶粉添加女贞子对羔羊生长性能、免疫和抗氧化功能的影响，为女贞子在将来无抗饲养提供基础研究数据。

1 材料与方法

1.1 女贞子粉制取 女贞子果实购于沈阳同仁堂药店，用微胶囊技术进行处理以增加其悬浮性。女贞子果实在65℃烘箱中烘干48 h。冷却到室温时，用药物专用粉碎机粉碎（HK1100B，哈尔滨制药六厂），过100目筛。流体床（Type TL-GHX-IIα，江苏）对女贞子粉末制粒。具体参数：床扇速度1 150 r/min，泵速7 min-1，雾化压力0.16 MPa，物料温度40～45 ℃，制粒时间45 min。5.0% 麦芽糊精（w/v）和0.15% 黄原胶（w/v）用作粘合剂。制粒后取样，用高效液相色谱测定熊果酸（OA）和齐墩果酸（UA）含量（Waters Technologies Inc.，USA）。0.5 g 粉末溶解于25 μL 甲醇。超声波提取30 min 并且用0.4 μm 滤膜过滤。取1μm 进样。色谱柱子为 ACE EXCEL 3 μm Super C18，50 mm×2.1 mm柱子，条件：40℃，流速0.42 mL/min，检测波长214 nm，流动相为乙腈-甲醇-水，含有0.1%磷酸（52:33:15，三乙胺调整pH 到6.5）；雄果酸和齐墩果酸的出峰时间分别为11.51 min 和12.31 min。女贞子粉颗粒13.263 mg/gOA和2.771 mg/gUA。土霉素购自于Bayer-Sino 公司（德国）。

1.2 代乳粉试验 在山东省莘县天牧母羊饲养场进行。母羊饲喂全混合日粮（TMR），精粗比为65:35（干物质基础），自由采食。粗饲料为羊草和黄贮，各占50%。精饲料含有粗蛋白质217 g/kg，总可消化养分为736 g/kg，由北京三元禾丰牧业有限公司提供。选择泌乳日龄为5～55 d 的第2 胎母羊60 只分析其乳成分（NIR，Milko-Scan 133B；Foss Electric，DK-3400 Hillerød，Denmark）。水分和灰分采用AOAC（1997）的方法。每只母羊乳取5 mL，混合60 只母羊乳，冻干，原子吸收法分析常量元素Ca、Mg、Na、K 含量和微量元素Zn、Mn、Co、Fe、Cu、Se 含量（AAS-3000，DAFURY，北京）。湖羊母羊乳蛋白、乳脂肪和乳糖含量分别为4.45%、5.58%和4.58%。代乳粉配方及营养成分见表1。

1.3 试验设计 试验采用完全随机试验设计。选择3 日龄羔羊90 只（从母羊分离），随机分成3 组，每组5个重复，每个重复6 只羔羊，公、母各半。对照组为代乳粉组，女贞子粉组饲喂为代乳粉+30 g/kg 女贞子粉），土霉素组为代乳粉+1 g/kg 土霉素。每个重复羔羊单栏人工饲养。试验期为2017 年5 月10 日—2017 年6 月26 日，期间平均环境温度为14.9～19.8℃。

1.4 饲喂管理 选定的羔羊打耳标并精确称重。每周用ClO2对所有围栏消毒1 次。代乳粉在36℃蒸馏水条件下按照16.7%（w/v）比例进行混合。采用自制喂奶器进行饲喂。每个喂奶器上安装有6 个人工乳头。初生1～3 d 采食初乳（免疫球蛋白浓度在5 000～8 000 mg/100mL）；第4～10 天每天饲喂4 次，每次25 g 代乳粉；第11～18 天每天饲喂3 次，每次38 g 代乳粉；第19～46 天每天饲喂2 次，每次50 g 代乳粉；第46 天断奶；自由饮水，第4 天开始自由采食紫花苜蓿和精饲料（北京三元禾丰牧业有限公司）。精补料（不添加药物）为颗粒饲料：55%粉碎玉米，14%粉碎燕麦，25%粉碎大麦，5%甜菜糖蜜和1%预混料。每千克精补料含有代谢能12.17 MJ，蛋白质105 g，钙1.5 g，维生素A 6 500 IU，维生素D31 000 IU，维生素E 75 mg 和硒0.3 mg。记录每天紫花苜蓿和颗粒饲料的采食量。每天观察羔羊的健康、腹泻和真胃臌气情况。羔羊尾根处有明显粪污视为腹泻，腹泻率=组内腹泻羔羊数/ 组中羔羊数×100%。羔羊腹部有明显充气（鼓肚子）视为真胃臌气。

表1 代乳粉配方组成及营养成分（湿基）

1.5 测定指标及方法

1.5.1 血样及血液指标 分别在10、17、24、31 日龄晨饲前对每个重复3 只羔羊颈静脉采血。血液样品在37℃水域斜面条件下静置1.5 h。取上清液储存于-20℃冰箱中待测。血清IgA 和IgG 和IgM 用ELISA 试剂盒进行测定（Montgomery，TX，USA）。前列腺素（PGE2）和可的松采用试剂盒进行测定（上海酶联科技有限公司）。血清IL-1β、IL-6 和IL-8 采用ELISA 试剂盒进行 测 定（Groundwork Biotechnology Diagnosticate，San Diego，CA，USA）。血清谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）采用试剂盒进行测定（北京索莱宝科技有限公司）。

1.5.2 体尺及体重 根据Adebayo[9]的方法在46 日龄测定体重和体尺，体尺指标包括肩胛高度、尻高度、体长和胸围。

1.6 统计分析 采用SAS 9.1 软件中One-Way ANOVA过程进行统计分析。羔羊腹泻率和腹泻天数采用卡平方χ2检验。显著水平为P＜0.05。

2 结果分析

2.1 添加女贞子对羔羊腹泻和真胃臌气的影响 从表2可以看出，试验期内所有羔羊无死亡现象。对照组羔羊的腹泻率和腹泻天数分别70% 和46 d，高于女贞子组和土霉素组（P＜0.05）。女贞子组和土霉素组羔羊没有真胃臌气发生。

表2 添加女贞子对羔羊腹泻率，死亡和真胃臌气的影响

2.2 添加女贞子对羔羊饲料采食量、体重和体尺指标的影响 从表3 可以看出，女贞子组和土霉素组羔羊的精饲料采食量都高于对照组（P＜0.05）。女贞子组羔羊的紫花苜蓿采食量高于其他2 组（P＜0.05）。女贞子组和土霉素组羔羊的末重和平均日增重均高于对照组（P＜0.05）。女贞子组和土霉素组羔羊的肩胛高度、尻高度、体长和胸围均高于对照组（P＜0.05）。

2.3 添加女贞子对羔羊血液免疫球蛋白和白细胞介素的影响 如表4 所示，土霉素组和女贞子组羔羊17、24 日龄血液IgG 浓度高于对照组（P＜0.05），女贞子组和土霉素组羔羊的IgG 浓度无显著差异。代乳粉中加入女贞子或土霉素在整个试验期并未改变羔羊的血液IgE 和IgA 浓度（P＞0.05）。女贞子组和土霉素组羔羊17、24、31 日龄血液IL-1β、IL-6 和IL-8 浓度均较对照组低（P＜0.05）。

表3 添加女贞子对羔羊采食量、体重和体尺指标的影响

表4 女贞子对人工饲喂羔羊免疫的影响

2.4 添加女贞子或者土霉素对羔羊应激激素的影响 从表5 可以看出，女贞子组和土霉素组羔羊24、31 日龄血液可的松、PGE2浓度均低于对照组（P＜0.05）。女贞子组和土霉素组羔羊的可的松浓度和PGE2浓度无显著差异。

表5 女贞子对人工饲喂羔羊应激激素的影响

2.5 添加女贞子对羔羊血液抗氧化功能的影响 如表6所示，女贞子组和土霉素组羔羊24、31 日龄血液SOD浓度均高于对照组（P＜0.05）。女贞子组和土霉素组羔羊17、31 日龄血液MDA 浓度低于对照组（P＜0.05）。

表6 女贞子对人工饲喂羔羊抗氧化功能的影响

3 讨 论

3.1 代乳粉对真胃臌气率和腹泻率的影响 关于代乳粉对山羊羔羊的生长、消化和代谢的影响已有较多研究报道。鲜有针对于绵羊羔羊进行的试验研究。Anderson 等[3]报道，绵羊乳成分与山羊乳成分有很大区别。绵羊乳的乳蛋白和乳脂肪高于山羊，而乳糖低于山羊[4-6]。Pulina等[10]报道，Sarda 母羊（意大利绵羊）乳中脂肪和蛋白质分别达6.5%和5.8%。本试验所测得的湖羊乳蛋白、乳脂肪和乳糖含量分别为4.45%、5.58%和4.58%。这些结果说明羊乳的成分构成存在种属特异性，山羊与绵羊乳成分有差异，而且不同品种绵羊的乳成分上也有差异。Edward 等[2]报道，臌气是由似肉瘤细菌（Sarcina-like bacteria）引起，这种菌栖居在幼龄反刍动物胃肠道中，对乳糖发酵速度较快，产生较多的气体，引起臌气。本试验制备的代乳粉中含25% 乳糖。而牛乳中的乳糖含量较高，一般为35%～39%。本试验使用的代乳粉营养组分与母乳相近，可较好预防真胃臌气的发生，这说明羔羊真胃臌气很有可能与代乳粉中乳糖比例有关。对照组羔羊较高的腹泻率和较长的腹泻天数说明代乳粉中添加女贞子粉或土霉素可较好预防羔羊腹泻。

3.2 添加女贞子粉对羔羊采食量和生长性能的影响 初生幼畜会受到一些环境致病菌（如大肠杆菌和真菌等）侵染。这个时期的家畜很容易处于应激状态，采食量降低，生产性能也随之降低。本研究结果表明，对照组羔羊精饲料采食量和生产性能均有所下降，体尺指标下降；而添加女贞子的代乳粉提高了羔羊紫花苜蓿的采食量，且体重和体尺指标均较对照组有显著提高。Qiao 等[7]试验结果发现，添加女贞子（100 g/d）提高了荷斯坦后备牛对纤维的采食量和消化率。这可能是由于女贞子粉提高了瘤胃内纤维降解菌活性，从而提高了纤维的消化率。但需要进一步用体内试验证实这一论断。

3.3 添加女贞子粉对羔羊免疫功能的影响 中草药可以加强肉仔鸡[11]、蛋鸡[12]、仔猪[13-14]、绵羊[8]、后备牛[7]和奶牛[15]等动物的免疫功能、提高血浆IgG 和IgA 浓度。本试验结果表明，3 个处理组羔羊24 日龄血浆IgG 浓度下降趋势一致，31 日龄开始提高。这与Lindsey 等[16]在犊牛上的研究结果一致。这一现象表明羔羊24 日龄内的免疫功能主要来源于母乳中的IgG，属于被动免疫。而在31 日龄以后羔羊需要动员机体功能来建立自身的主动免疫，合成自身的抗体。本试验中女贞子组和土霉素组的羔羊24 日龄前血浆IgG 的下降趋势明显低于对照组，表明添加女贞子粉或土霉素的代乳粉可以起到抵抗病原微生物和减少对母乳中IgG 消耗的作用。

熊果酸、齐墩果酸、二氢熊果酸和优帕托林是女贞子的主要有效成分，尤其是熊果酸和齐墩果酸（均属于五环三萜类羧酸）有抵抗病原菌、抗炎症和降低IL-1β、IL-6 和TNF-α的作用[17-19]。本试验使用的女贞子果实中含有齐墩果酸和熊果酸的含量分别为2.77、13.26 mg/g。细胞因子（如IL-1β、IL-6 和IL-8）可反映机体免疫状态，其中IL-1β是必需促炎症因子，起到调控肿瘤细胞的作用，IL-6 是肿瘤细胞分泌的细胞因子，而IL-8 是介导急性炎症反应的主要细胞因子[20]。Alejandra 等[17]报道，0.5 mg/kg 体重的熊果酸降低了炎症因子IL-6 水平，提高了大鼠的免疫状态。Seungye 等[18]报道，熊果酸显著降低了炎症反应，伴随着抑制促炎症因细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-21 和IL-17 的表达，同时降低了氧化应激标记物——硝基酪氨酸和诱导性一氧化氮合酶（iNOS）的表达，结果NO合成量降低。Feng 等[19]进一步在脂多糖诱导NO 炎症大鼠的研究证实，齐墩果酸和熊果酸表现出了较高的抑制NO 合成的作用，其机理是抑制NO 合成，从而发挥抗击炎症的作用。从整个试验来看，对照组羔羊的IL-1β、IL-6 和IL-8 水平有所提高，而女贞子组和土霉素组羔羊17～31 日龄IL-1β、IL-6 和IL-8 水平显著降低。这说明对照组羔羊处于相对较差的免疫状态，同时说明女贞子是通过抑制炎症因子IL-1β、IL-6 和IL-8 来提高羔羊的免疫状态。女贞子是否可以抑制NO 合成，需要进行体内试验证实。

3.4 添加女贞子对羔羊应激激素的影响 在猪[21]、山羊[22]、母猪[23]上的研究发现，从母畜隔离的初生家畜会受到很多环境因素影响，其中包括病原微生物、低温环境和代乳粉。这些应激因素刺激来源于下丘脑-肾上腺轴的可的松和PEG2分泌，进而降低精饲料采食量和生长性能，并且使初生家畜的健康状态和免疫状态恶化。本试验中，对照组羔羊血清可的松和PGE2水平高于其他2个组，表明对照组羔羊处于较大程度上的应激状态。羔羊较低的采食量和较低生长性能可能与应激激素水平提高有关。

3.5 添加女贞子对羔羊抗氧化状态的影响 相关研究指出，当动物处于较差的抗氧化状态时，总是伴随着低浓度的血液SOD 和/或GSH，和较高浓度的MDA，同时生产性能明显降低[7,12]，血液SOD 和/或GSH、MDA（细胞膜脂质氧化的终产物）分别与动物的抗氧化状态呈正相关、负相关。由于细胞膜不饱和脂肪酸的氧化使细胞膜的正常结构和功能遭到破坏，造成生产性能降低[24]。熊果酸和齐墩果酸是女贞子的主要活性成分，有提高抗氧化和保护肝脏的作用[12]。Chen 等[25]报道，齐墩果酸和熊果酸都有稳定脂质体膜的作用，同时证明女贞子水提物有改善氧化还原稳态的作用，机理是通过增加血清总抗氧化能力来降低MDA 和8-羟基脱氧鸟苷。本试验中，添加女贞子改善了血液抗氧化功能，提高了SOD 水平，降低了MDA 水平，表明添加女贞子可提高羔羊抗氧化性能。

4 结 论

试验用代乳粉的营养成分与母羊的自然乳基本一致，可以有效降低羔羊真胃臌气的发病率；添加女贞子粉的代乳粉可以降低腹泻的发生率，还可以降低促炎症因子IL-1β、IL-6 和IL-8，通过提高IgG 水平改善羔羊主动免疫功能，并且可以通过降低可的松和PGE2水平来缓解应激；同时通过提高SOD 和降低MDA 的方式来改善抗氧化状态。