母体埋植褪黑激素对子一代獭兔内脏组织中RORα 基因表达的影响

康 景，封 洋

（甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070）

褪黑激素（MT）是由Lerner 在牛松果体中分离和鉴定出来的一种吲哚类激素[1]，是影响毛皮动物绒毛生长发育的重要因素。目前，MT 在畜禽中的研究应用主要集中在调控生殖、提高免疫及诱导毛皮动物毛囊发育等方面[2]，尤其在促进狐、水貂等贵重毛皮动物毛囊发育和皮张提前成熟方面具有重要作用。德吉等[3]曾报道，外源性MT 能够提高藏西北绒山羊血清中的MT 浓度，并显著提高其绒毛的纤维长度及生长速度。何茂昌等[4]也证实了外源性MT 可激活次级毛囊，使陇东绒山羊的毛囊活率显著提升。但由于MT 能抑制动物的生殖活动[5]，因此在生产中只应用于商品类畜禽，而不予在种畜上使用，这在一定程度上降低了经济效益。郭雪峰等[6]研究表明哺乳动物毛囊的发生始于胚胎期，而刘宪明[7]认为影响动物毛囊发育的主要因素是遗传。诸多研究均证实毛囊密度在哺乳动物胎儿时期就已成型，出生后依靠外界条件加以改善的可能性较小，且本实验前期研究也证实了獭兔母体埋植MT 后可促进子代兔的毛囊发育（尚未发表）。因此，除选种选育外，从胎儿时期改变毛皮动物的毛囊密度是目前研究的主要方向。

RORα（Retinoid Avid Receptor Related Orphan Receptor a，RORα）基因是维甲酸相关孤核受体亚家族成员之一，同时也作为MT 的受体对促进毛皮动物绒毛生长及毛囊发育起到重要作用[8]。段春辉等[9]在探究MT 调控山羊绒生长的模式及机理的过程中发现，外源性MT 可通过提高内源性MT 的浓度使RORα基因表达量上升，从而促进绒山羊产绒。吴静等[10]也发现MT可与毛囊及毛乳头中的RORα基因结合，达到调控毛囊周期性生长的目的。

近年来，学者们在绒山羊、大鼠、水貂等多种毛皮动物自身探究了外源性MT 促进绒毛生长的分子机理，但关于母体埋植MT 对子代动物内脏组织中RORα基因表达的影响尚未见相关报道。本实验在獭兔母体皮下埋植MT，探讨RORα基因在子一代兔内脏组织中的表达规律和MT 对此规律的影响，为进一步研究MT 与动物产绒性能之间的关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 实验选择相近月龄健康母獭兔110 只，獭兔来自甘肃省远发牧业有限公司獭兔场。

1.1.2 主要仪器 震荡仪（德杜精密仪器有限责任公司，中国江苏）、PCR 扩增仪（宝日医生物技术有限公司，中国北京）、微量移液枪（上海艾测电子科技有限公司，美国）、电泳仪、离心机（北京时代北利离心机有限公司，中国北京）、微量离心管、恒温水浴锅、紫外透射仪。

1.1.3 主要试剂 核酶、引物、转录酶、Tap 聚合酶、dNTP、琼脂糖、缓冲液、灭菌水。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计 选择110 只相近月龄的健康母獭兔同日配种，第5 日后选出已确定妊娠的母兔76 只，随机平均分为2 组，对照组母兔不做处理；试验组母兔埋植10 mg MT。仔兔在出生第1 天时，每组选15 只宰杀，取皮肤、肌肉、肺脏、心脏、肝脏、肾脏及十二指肠组织样品，测定仔兔组织样品中RORα基因的表达量。

1.2.2 引物信息表 引物信息见表1。

表1 引物信息

1.2.3 RNA 提取及cDNA 合成 参照TaKaRa 试剂盒说明进行RNA 的提取和cDNA 的合成。

1.2.4 Real Time PCR 扩增 以总RNA 反转录得到的cDNA 作为模板，在荧光定量PCR 仪上进行实时荧光定量PCR 扩增。检测反应液中TB Green 的荧光强度，从而监控PCR 产物的扩增量。总体系20 μL：TB Green Premix Ex Taq II 10 μL；DNA 模板2 μL；灭菌水6.4 μL；上、下游引物各0.8 μL。PCR 反应程序：95℃预变性30 s，1 个循环；95℃定量分析5 s；熔解曲线：95℃延伸5 s；60℃延伸1min 以终止反应，1 个循环。

1.3 统计分析 采用SPSS 21.0 软件分析2 组仔兔同一指标间RORα基因表达的差异性，所得数据均以“平均值± 标准误”表示，P＜0.05 表示差异显著；P＞0.05 表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1RORα基因PCR 产物检测 由图1 可知，以总RNA反转录后获得的cDNA 为模板，来检测PCR 引物的质量及PCR 最优条件。利用基因上、下游引物进行Real Time PCR 反应，反应所得电泳片段值与预期一致，说明基因引物扩增特异性良好，可用于荧光定量实验。

2.2 实时荧光定量PCR 扩增曲线 由图2 可知，扩增曲线呈“S”型，可明显区分平台期与指数期，这是由于随着扩增规模增大，各种要素逐渐被饱和，而产物增长速度逐渐减缓所致。

2.3 实时荧光定量PCR 熔解曲线 由图3 可知，RORα基因的熔解曲线为单峰，说明产物扩增效果良好，且扩增过程中产生的荧光信号均为特异性产物的荧光信号，无引物二聚体或非特异性扩增产生。

2.4RORα基因在不同组织中的表达量 由图4 可知，与对照组相比，RORα基因在试验组仔兔的皮肤组织中呈极显著上调趋势，在肌肉、肺脏组织中均呈显著上调趋势；在仔兔肝脏组织中呈极显著下调趋势，在心脏、肾脏组织中呈显著下调趋势；十二指肠中则表达不显著。

3 讨 论

3.1 母体埋植MT 对仔兔皮肤、肌肉、肺脏组织中RORα基因的影响 大量研究表明RORα基因在动物大脑、皮肤、胸腺、睾丸、子宫等器官中均有表达[11]，如Pozo 等[12]研究指出RORα基因在动物皮肤组织中表达量最高。常子丽等[13]研究发现随着自然光照时间的延长，RORα基因在内蒙古白绒山羊皮肤组织中的表达量也逐渐提高，故推测其与光周期的变化有关。赵艳红等[13]也证实了RORα基因在各月份绒山羊皮肤组织中均有表达，且不同月份之间的表达量存在一定差异，其中8 月长日照时期RORα基因表达量显著低于2 月的表达量，故推测该基因的表达可能与MT 水平的变化有关。张紫奇等[14]证实了在埋植MT 后RORα基因的表达量在内蒙古白绒山羊皮肤组织中呈显著上调趋势，这是由于RORα基因是MT 的受体，而毛囊是一种皮肤器官，因此该基因可能在皮肤组织中高表达[15]。本研究中，试验组仔兔皮肤组织中RORα基因的表达量极显著高于对照组，故推测MT 能通过母体埋植而提高RORα基因在子代兔皮肤组织中的表达量，由此达到改善子代兔毛囊发育的目的（本实验前期研究也已证实此结论），其原因可能是RORα基因参与了调节。

有研究表明，RORα基因在动物骨骼肌细胞和肌原细胞中也有表达。王康等[16]在检测外源性MT 在长毛兔肌肉组织中的残留量时，发现埋植过MT 的水貂和银霜狐肌肉组织中MT 含量高出对照组数十倍，原因是由于实验动物采用电击致死，血液大部分保留在胴体中，因此胴体中MT 含量较高。唐政[17]等研究发现，埋植MT 后，蓝狐和水貂肌肉组织中MT 含量均显著升高，故推测其受体RORα基因也可能在动物肌肉组织中高表达，这是由于MT 可上调MyoD 和p300 的表达诱导肌蛋白合成、促进骨骼肌细胞分化、维持肌细胞正常形态及生理功能。本研究结果显示，獭兔母体埋植MT 后，仔兔肌肉组织中MT 含量升高，其受体RORα基因的表达量与对照组相比也显著上调，说明外源性MT 可通过母体使其受体基因RORα在子一代獭兔肌肉组织中高表达。

由于RORα基因在动物肺脏组织中的表达尚未见相关报道，故此部位主要探讨ROR 家族中的另一相关基因——维甲酸相关核孤儿受体-γt基因的表达。王晓群等[18]在研究甲苯二异氰酸酯致哮喘的过程中发现ROR-γt基因在哮喘组小鼠肺部中的表达水平极显著高于对照组，这是由于小鼠体内Th17 细胞免疫失衡所致，而ROR-γt基因是Th17 细胞分化的转录因子，因此阻断ROR-γt基因表达可在一定程度上抑制Th17 细胞分化，从而达到减轻哮喘炎性反应的目的[19]。卞芳芳等[20]在探讨布地奈德治疗哮喘小鼠的机制时发现ROR-γt基因及IL-17 水平在哮喘小鼠肺组织中高表达，而BUD治疗组小鼠肺组织中的ROR-γt基因及IL-17 表达水平均显著低于哮喘组，因此，卞芳芳等认为BUD 可阻断该基因在肺部的表达并抑制IL-17 细胞的分泌，从而减轻哮喘炎性反应。故推测同为MT 受体的RORα基因也可能致哮喘，二者在动物肺脏组织中的表达可互作参考。本研究结果则显示，獭兔母体埋植MT 后，RORα基因在仔兔肺脏组织中的表达水平与对照组相比呈显著升高，说明外源性MT 可通过母体使其受体基因RORα在子一代兔肺脏中高表达，从而达到抑制Th17 细胞分化、减轻动物疾病发生的目的。

3.2 母体埋植MT 对仔兔肝脏、心脏、肾脏组织中RORα基因的影响 戚朝霞等[21]在探讨RORα基因在慢性乙型肝炎发病机制中的作用时发现，该基因及Th17 细胞水平在慢性乙型肝炎患者体内的表达水平显著高于对照组，这是由于RORα基因能够促进Th17 细胞的分化，从而诱发慢性乙型肝炎、慢性加急重型乙肝及原发性肝癌等疾病。RORα基因在动物心脏、肾脏组织中的表达虽未见相关报道，但对于同样作为褪黑激素受体的ROR-γt基因，颜玉鸾等[22]曾探究该基因在病毒性心肌炎小鼠心脏组织中的表达，结果发现ROR-γt在小鼠心脏组织中高表达。方明等[23]研究发现IgA 肾病患者外周血中ROR-γt基因表达水平显著高于对照组，其认为是Th17 细胞失衡介导了IgA 肾病的发生。本研究结果显示，獭兔母体埋植MT 后，RORα基因在仔兔肝脏组织中呈极显著下调；在心脏、肾脏组织中均呈显著下调，故推测母体埋植MT 可减少Th17 细胞的分化，进而降低疾病发生的概率，有益于动物健康生长，其原因可能与母体埋植MT 有关，这在一定程度上可能对该基因的表达产生影响。

有研究发现，除松果体外肠道是产生MT 的主要场所。Bubenik 最先证实MT 存在于肠道粘膜中[24]，且肠嗜铬细胞是胃肠道MT 的主要来源，其分布与肠嗜铬细胞密度呈正相关。研究证实，任何时刻肠道内MT 浓度至少比血浆中的浓度高10～100 倍[25]。黄群等[26]证实埋植MT 后，其另一受体基因MT1mRNA 在大鼠十二指肠中表达量高于其他肠道。而本研究结果显示，母体埋植MT 之后，RORα基因在仔兔十二指肠组织中的表达水平与对照组相比不显著，其原因可能与饲养管理及营养水平有关。

4 结 论

本实验条件下，母体埋植MT 后，RORα基因在仔兔皮肤、肌肉、肺脏组织中的表达与对照组相比均呈上调趋势，因此可为母体埋植MT 以提高仔獭兔的绒毛质量及产绒性能；RORα基因在仔兔肝脏、心脏、肾脏组织中的表达与对照组相比均呈下调趋势，即可降低动物疾病发生率及促进其健康生长；RORα基因在仔兔十二指肠中的表达与对照组相比则无显著影响。