白羽王鸽不同组织RT-qPCR 内参基因的筛选

陈 兰 ，郭丽燕，张 涛*，张闪闪，顾若君，张跟喜，谢恺舟，王金玉

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏扬州 225009；3.无锡三乡岸农业生态农业科技有限公司，江苏无锡 214100）

随着科技的飞速发展，分子生物学领域发展出多种测定基因表达量的方法，如半定量PCR 技术、Northern blot 技术、Western blot 技术、全基因组测序等，以上方法能精确检测基因表达量，但操作要求严格，成本较高。实时荧光定量PCR 技术是20 世纪末发展的新型核酸定量分析技术，具有灵敏度高、重复性好、特异性强和准确性高等优点[1-3]，该技术已被广泛用于基因表达的相关研究。然而，RT-qPCR 结果的准确性一定程度上取决于内参基因的选择，内参基因是为维持细胞基本生命活动而时刻都在表达的基因，其表达水平受环境因素影响较小，在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。在运用RT-qPCR 技术分析靶基因的表达水平时，需要利用合适的内参基因进行校正，弥补因不同样本在RNA 提取质量及总量、逆转录效率和PCR 扩增效率等可能出现的误差，以期能够准确反应靶基因间的表达差异性[4-5]。因此，内参基因选择正确与否直接关系到RT-qPCR 结果的准确性，为此，Vandesompele 等[6]、Andersen 等[7]、Pfaffl 等[8]分别开发geNorm、NormFinder、BestKeeper 软件和Ct 值分析法对内参基因稳定性进行评价。

3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、beta-肌动蛋白（β-actin）、18S 核糖体RNA（18S rRNA）和核糖体蛋白S2（Ribosomal protein S2，RPS2）等均是在不同动物RT-qPCR 研究中常用的内参基因[9-11]。目前，利用RT-qPCR 检测肉鸽基因表达的研究日益增多，然而有关肉鸽内参基因选择与稳定性的研究鲜有报道。因此，本实验利用RTqPCR 方法检测28 日龄乳鸽不同组织中常用内参基因的表达，采用geNorm、NormFinder 和BestKeeper 软件及Ct 值分析法对常见内参基因在肉鸽组织中的表达稳定性进行评估，筛选出用于肉鸽组织表达研究的最佳内参基因。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物为无锡三乡岸生态农业科技有限公司相同饲养条件下的白羽王鸽，选取28 日龄母鸽3 只，采取心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌、腹脂和卵巢组织，于装有RNA wait 样品保存液的无酶管中暂存，隔夜放置后于超低温冰箱（-70℃）长期保存待用。反转录试剂盒、荧光定量试剂盒和RNA wait 样品保存液均购自天根生化科技（北京）有限公司，荧光定量PCR 板（96 孔）购自美国ABI 公司，RNA free water、Trizol、DEPC、PCR 管、异丙醇、无水乙醇、无酶管、无酶枪头、离心管等均购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 引物合成 根据GenBank 上的原鸽（Columba livia）GAPDH（登录号：NM_001282835.1），β-actin（登录号：XM_005504502.2）、18SrRNA（登录号：AF173630.1）和RPS2（登录号：XM_021300650.1）基因mRNA 序列，使用Premier 6.0 跨内含子分别设计1 对RT-qPCR 引物，引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列信息见表1。

表1 荧光定量PCR 引物

1.3 总RNA 提取及cDNA 合成 使用Trizol 法提取心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌、腹脂、卵巢组织的总RNA，Nano-Drop-1000 微量核酸测定仪检测总RNA 纯度和浓度，-70℃保存待用。反转录按照天根生化科技公司的反转录试剂盒操作程序进行，体系为50 µL：5×FastKing-RT SuperMix 10µL，加入1 500 ngRNA 模板，加入RNA-Free ddH2O 补足至50 µL，反转录反应温度为42℃ 15 min 去除基因组及反转录反应，95℃ 3min酶灭活，然后置于-20℃保存。

1.4 标准曲线绘制及RT-qPCR 检测 使用SYBR Green染料荧光定量试剂盒进行定量分析，取一定量cDNA模板按照10 倍梯度稀释成5 个梯度，以5 个梯度浓度的cDNA 为模板进行RT-qPCR 检测，利用ABI 7500 Software v2.3 软件分析数据，生成基因的标准曲线和熔解曲线。随后利用RT-qPCR 检测4 个基因在不同组织中的表达，20 µL 反应体系：2×SuperReal Color PreMix 10µL，正反向引物各0.6 µL（浓度为10 μmol/μL），50×ROXReferebnce Dye 0.4 µL，cDNA 模板2 µL（浓度为：500ng/μL），RNase-free ddH2O 补 足 到20 µL。RTqPCR 两步法反应程序为：95℃预变性15 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，40 个循环。

1.5 统计分析 采用2-△ct（△Ct=各样本最大Ct 值-各样本最小Ct 值）方法计算相对表达量，利用geNorm、NormFinder 和BestKeeper 程序以及Ct 值差异比较分析法分析4 个内参基因在肉鸽不同组组织中Ct 值变化，综合评估表达稳定性。GeNorm 软件分析是先将2-△ct方法计算出内参基因相对定量数据，制作Excel表格，然后将其导入geNorm 程序中进行计算，获得每个内参基因稳定性的M 值来判定出较好的内参基因。NormFinder 程序的计算分析方法与GeNorm 程序相似，均是采用2-△ct方法计算出内参基因相对定量数据，导入NormFinder 程序，获得内参基因表达的稳定性M 值。BestKeeper 程序是采用的公式内置的形式，主要是计算每个内参基因之间产生配对的标准偏差（SD）、变异系数（CV）和内参基因Ct 值的几何平均数（GM）产生BestKeeper 指数，判定标准：SD 值和CV 值越小，内参基因的稳定性越好。Ct 值分析法是采用同一内参基因在不同组织中通过RT-qPCR 获得的相对定量数据，计算出△ct 值进行判定（判定标准：△ct 值越小，表达越稳定）。

2 结果与分析

2.1 总RNA 检测 利用1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 质量，结果可见条带清晰，说明RNA 完整性良好（图1）。

2.2 PCR 扩增结果 利用已设计好的GAPDH、β-actin、18S rRNA和RPS2基因的引物，用逆转录产物cDNA为模板进行PCR 扩增，所得产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。在96、131、145 bp 处检测到特异性条带，条带长度与预期相符，条带清晰无拖尾，说明引物特异性良好，模板cDNA 完整性好。

2.3 各内参基因标准曲线和熔解曲线分析 熔解曲线结果显示（图3），4 个内参基因均为单峰，Tm 两侧均无杂峰；由表2 可知，4 个基因回归系数R2均大于0.99，扩增效率介于96%～111%，Ct 值和起始模板浓度对数都呈现良好的线性关系，表明所设计引物特异性好，无引物二聚体、非特异性聚合及基因组污染而产生的非目的荧光。

2.4 内参基因表达稳定性分析 GeNorm 软件分析，是先将2-△ct方法计算出内参基因相对定量数据，制作Excel 表格，然后将其导入geNorm 程序中进行计算，获得每个内参基因稳定性的M 值来判定出较好的内参基因（软件判定标准：M 值越小内参基因越稳定，反之稳定性就越差）。由图4 所示，4 个内参基因在组织表达的稳定性各异，表达稳定性由高到低依次为18S rRNA＞RPS2＞β-actin＞GAPDH。

如图5 所示，NormFinder 软件分析4 个内参基因在白羽王鸽的不同组织中表达稳定性M 值依次为18S rRNA＞RPS2＞β-actin＞GAPDH，根据NormFinder 程序的判定方法（M 值越小基因表达量越稳定）筛选出最佳的内参基因是18S rRNA，RPS2次之，β-actin的表达稳定性高，而GAPDH最差。

如表3 所示，Bestkeeper 分析内参基因在鸽子各组织中的表达稳定性由高到低依次为RPS2＞18S rRNA＞βactin＞GAPDH，通过BestKeeper 程序计算，可判定RPS2内参基因的表达最稳定，18S rRNA次之，β-actin的表达稳定性高，而表达稳定性最差的是GAPDH。此分析结果与GeNorm 软件分析的结果一致。

内参基因分析结果显示，18S rRNA、RPS2、β-actin和GAPDH的△ct 值分别为1.83、2.47、3.74、5.22。通过Ct 值分析法可判定18S rRNA基因表达稳定性最强，RPS2次之，表达稳定性最差的是GAPDH。

表2 内参基因标准曲线方程、回归系数R2 和扩增效率

3 讨 论

目前，实时荧光定量PCR 技术已被广泛应用于基因表达的定量研究，为减小偏差，需要选用合适的管家基因对靶基因进行校正。Lossos 等[12]研究显示，目前还没有能够适用于各种细胞类型、不同组织的内参基因。在肉鸽中，尚未出现内参基因筛选到的相关报道。本研究发现，不同的分析程序得出的结果有所差异。其中，采用geNorm 程序分析，结果显示稳定性最高的内参基因为18S rRNA；NormFinder 程序的分析原理与geNorm 程序相似，其分析结果一致，均表明18S rRNA稳定性最佳；利用BestKeeper 软件进行分析，结果表明RPS2基因表达最稳定，Ct 值分析法结果表明18S rRNA的△ct 值最小，稳定性最强，与geNorm、NormFinder 软件分析结果一致。

表3 Bestkeeper 分析内参基因在鸽子各组织中的表达稳定性的相关参数

Faccioli 等[13]研究表明利用单个管家不能保证一个公正的结果，由于不存在适合于每一个实验条件的标准基因，因此还需要在计划实验的特定要求上验证每一个候选内参基因的表达稳定性，筛选出一套最佳的内参基因，才能得出真实可靠的定量数据。杨显英等[14]在评估小鼠卵巢发育过程中内参基因时发现，GAPDH和β-actin在小鼠的卵巢发育过程中能够稳定表达，是最佳的内参候选基因组合。刘圆等[15]利用RT-qPCR 技术对茶树在不同氮浓度处理条件下进行定量分析时发现，GAPDH+β-actin组合稳定性最佳，可作为研究茶树基因表达的内参基因。张蓉等[16]采用实时荧光定量PCR技术对海兰灰蛋鸡的内参基因进行定量分析，筛选出最佳的内参基因组合为RPS2+β-actin基因。张蓉等[17]在不同GluN 处理下产蛋后期笼养蛋鸡基因表达中，能够稳定表达的内参基因是RPS2和TBP基因。本研究通过4 种内参基因专用评估软件筛选在鸽同一时期不同组织中稳定表达的内参基因，BestKeeper 程序分析显示RPS2基因稳定性最好，而geNorm、NormFinder和Ct 值分析法分析显示18S rRNA基因表达稳定性最强。因此，建议在白羽王鸽不同组织RT-qPCR 检测时RPS2+18S rRNA为最佳内参基因组合。无论是用单个内参基因还是用多个内参基因对基因定量分析，筛选出合适的内参基因是得到可靠定量数据的重要前提，本实验结果为课题组今后开展白羽王鸽基因表达分析提供了理论参考。

4 结 论

本实验结果显示，GAPDH基因稳定性差，不适合作为鸽子的内参基因；而RPS2基因和18s RNA 的稳定性均强，推荐RPS2+18sRNA的内参基因组合用于鸽子不同组织基因表达的研究。