PD-1在巨噬细胞中的表达及对其功能的调控

江懿佳 王青青 刘 杨

(浙江大学医学院免疫学研究所，杭州 310058)

淋巴细胞活化受共刺激分子和共抑制分子共同调节，这些抑制性分子称为免疫检查点，即免疫系统活化保持在正常范围之内的关键点[1]。T细胞通过T细胞受体(T cell receptor，TCR)识别抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)上的抗原肽——主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)复合物，与此同时T细胞共刺激分子CD28与APC上的CD80(B7.1)或CD86(B7.2)相互作用，提供共刺激信号，导致T细胞活化[2]。在早期T细胞活化中，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4)作为免疫检查点，直接与CD28竞争结合CD80和CD86下调免疫应答[3]。而另外一个免疫分子检查点——程序性死亡受体(programmod cell death-1 recepter,PD-1)，在维持免疫平衡和免疫耐受上也有重要作用。然而，在慢性疾病和肿瘤发生时，PD-1会限制保护性免疫，从而导致免疫逃逸。PD-1与相应配体结合后，会抑制CD28导致的T细胞活化、增殖及细胞因子的产生并可能导致T细胞凋亡[4]。PD-1还可抑制B细胞受体(B cell receptor,BCR)介导的B细胞活化，从而抑制B淋巴细胞的增殖和抗体的生成[5]。PD-1的既往研究主要集中于淋巴细胞，近年来发现其在巨噬细胞固有免疫应答中也发挥重要作用。

1 PD-1的结构和表达

PD-1即CD279，是由288个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜蛋白受体，属于CD28免疫球蛋白(Ig)超家族，由三个结构域组成，分别为免疫球蛋白样结构域、疏水跨膜区和胞内区。胞内区由免疫受体酪氨酸转换基序ITSM(immunoreceptor tyrosine-based switch motif)和免疫受体酪氨酸抑制基序ITIM(immunor-eceptor tyrosine-based inhibitory motif)组成[6]。PD-1主要表达于T淋巴细胞和前体B淋巴细胞，在初始T细胞上不表达，在接触外来抗原或自身抗原后，初始T细胞被活化从而表达PD-1[7]。PD-1的表达程度与抗原刺激程度相关，当抗原被立刻清除(如在急性疾病发生)时，相应T细胞上的PD-1表达量减少；而在慢性感染或者肿瘤中，由于抗原的持续刺激，T细胞上PD-1可持续高表达[8,9]。PD-1在细胞表面的表达可在刺激后24 h内检测，但在T淋巴细胞活化几小时内就可发挥功能[10]。除了T、B淋巴细胞外，PD-1还可表达于NK细胞(natural killer cells)、NKT(natural killer T cells)、活化单核细胞，树突状细胞DCs(dendritic cells)等髓系细胞、APC细胞及肿瘤细胞和固有淋巴细胞[6，11，12]。PD-1在活化T淋巴细胞上的表达主要受NFATC1(nuclear factor of activated T cells，cytoplasmic 1)、FOXO1 (forkhead box protein O1)，T-bet(T-box expressed T-cells)和BLIMP1 (B lymphocyte-induced maturation protein 1)等转录因子调控[13]。此外，PD-1表达可能还受表观修饰调控，使其在抗原被清除后还能持续表达，但具体机制还有待深入研究[14]。在肿瘤微环境中，PD-1表达上调，其配体表达水平也会随之增高[15]。

2 PD-1配体

PD-1通过与其配体PD-L1(programmed death-ligand 1，即B7-H1，CD274)和PD-L2(即B7-DC)结合发挥功能[16]。PD-L1和PD-L2主要区别在于其表达模式。PD-L1广泛表达于各种细胞，其在淋巴细胞、DC细胞和巨噬细胞等造血细胞和血管内皮细胞及各种肿瘤细胞系等非造血细胞上均有分布[6，17]。前炎症因子如Ⅰ型和Ⅱ型干扰素、TNF-α、IL-27等都可促进PD-L1表达[18，19]。以干扰素为代表的细胞因子是PD-L1的主要调节分子，其在肿瘤中会形成适应性免疫耐受，即由T淋巴细胞等产生的前炎症因子会上调PD-L1表达，是PD-1/PD-L1作为免疫检查点的重要负反馈机制。PD-L2的表达相较于PD-L1相对局限，其主要分布于DC细胞、巨噬细胞、B细胞和骨髓来源肥大细胞，可被一些细胞因子诱导表达，如IL-4、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和IFN-γ等[20-22]。PD-L1和PD-L2与PD-1的亲和力也不同，PD-L2与PD-1结合亲和力约为PD-L1的3倍[17]。

3 PD-1胞内信号和分子机制

PD-1信号通路的研究主要在活化T淋巴细胞内进行。PD-1通过与其配体结合导致ITSM/ITIM基序磷酸化，从而招募酪氨酸磷酸酶(SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-1，SHP-1)和SHP-2，SHP-1和SHP2可通过使相应激酶去磷酸化从而抑制这些激酶活化，比如可通过抑制PI3K-Akt(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B)通路及磷脂酶C-γ1(phospholipase C-γ1,PLC-γ1)和其下游的有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路抑制TCR受刺激后导致的T细胞存活、活化、增殖、细胞因子的产生及细胞内代谢改变，提示PD-1在T细胞免疫耐受和肿瘤免疫逃逸中发挥重要功能[4，17，23，24]。

4 巨噬细胞的分类和功能

巨噬细胞功能的多样性导致其存在多种分类方式。根据其免疫功能可分为M1型巨噬细胞即经典激活的巨噬细胞(classically activated macrophages)和M2型巨噬细胞即替代激活的巨噬细胞(alternatively activated macrophages)[25]。M1型巨噬细胞在IFN-γ、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、GM-CSF等刺激下分泌IL-1β、TNF-α及IL-12等促炎症因子，协助Th1细胞发挥抗感染功能[26]。M2型巨噬细胞是在Th2细胞分泌的细胞因子如IL-4和IL-13等作用下分化形成，主要参与纤维化、组织修复和体液免疫，是一种“抗炎性”巨噬细胞[27]。肿瘤中存在一群肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)，TAM并不是严格意义上的巨噬细胞亚群，其不在稳态条件下存在，而是存在于许多肿瘤中。TAMs具有表型可塑性，其可在不同的微环境中会发生不同的极化，既可向炎性的M1型极化，也可向M2型(pro-tumor)分化，M2型巨噬细胞与肿瘤血管生成及代谢相关，并通过分泌细胞因子抑制T细胞功能，促进肿瘤生长[28-30]。成胶质细胞瘤(GBM)细胞中ERK1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2)信号通路增强，肿瘤细胞产生大量单核细胞趋化因子CCL2/MCP1(chemokine C-C motif ligand 2/monocyte chemotactic protein 1)和CSF1/MCSF(colony-stimulating factor 1/monocyte colony-stimulating factor)，导致大量TAMs浸润，并向M2极化，重塑肿瘤微环境。

5 PD-1在巨噬细胞上的表达及对巨噬细胞功能的调控

PD-1主要表达于活化的T淋巴细胞，目前大部分研究焦点都集中于T淋巴细胞PD-1的表达及对其的阻断效应上。研究发现，PD-1在固有免疫应答中也可发挥作用。

PD-1的表达对DC细胞功能起负调控作用，PD-1敲除小鼠对李斯特菌感染的抵抗能力增强，分泌更多的IL-12和TNF-α[31]。PD-1在巨噬细胞中也有表达[32，33]，但相比于活化状态的T淋巴细胞，巨噬细胞表面PD-1表达水平较低，需要一定的刺激活化，如LPS、IFN-α等[32-35]。当给予RAW264.7细胞系LPS刺激时，其会上调PD-1表达，并通过募集SHP-2到PD-1胞浆尾部结构域，抑制JNK(c-Jun N-terminal kinase)和PI3K/Akt信号通路活化，从而影响巨噬细胞功能成熟及共刺激分子表达[34]。

5.1PD-1与TAMs 有研究发现在病原体感染时，巨噬细胞会在肿瘤中表达高水平的PD-1，但其机制目前尚不明确。PD-1+TAMs有类似于M2型巨噬细胞的表面分子表达模式和功能，如CD206和IL-10表达持续增强；HLA-DR、CD64和IL-12表达降低；抑制CD8+T细胞能力显著增强，其中单核细胞分化为PD-1+TAMs在肿瘤细胞浸润并出现M2表型可能与肿瘤来源的外泌体相关[36]。而PD-1-TAMs的表达谱则与M1型巨噬细胞相似，Gordon等[37]发现PD-1+TAM吞噬肿瘤细胞能力受到抑制，提示阻断PD-1/PD-L1通路治疗可能通过影响巨噬细胞功能发挥抗肿瘤作用。有研究发现，当PD-1敲除后，酵母聚糖可促进炎症发生，巨噬细胞向M1型而不是M2型极化，可能是由于PD-1敲除后胞内STAT1/NF-κB活化增强，同时STAT6信号通路活化减弱。

5.2PD-1与巨噬细胞凋亡 PD-1在许多凋亡细胞上过表达，可介导T细胞凋亡[38]。有研究发现PD-1还与巨噬细胞的凋亡相关。双氧水处理后的巨噬细胞PD-1表达增加，其通过PD-1-SHP2通路抑制细胞生长和存活通路AKT活化，导致巨噬细胞凋亡增加。而当杜氏利氏曼虫感染巨噬细胞时，其可通过使活化T-细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells，NFATc1)失活降低PD-1表达，从而抑制巨噬细胞凋亡[39，40]。

5.3巨噬细胞上PD-1的表达与炎症 脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征，其过度且失控的炎症反应会导致免疫功能障碍，最终造成持续感染和严重的机体损伤[41]。巨噬细胞在这个过程中起关键作用，因为固有免疫是宿主抵抗感染的第一道防线，巨噬细胞能高效清除病原体，并且是炎症因子最重要的来源[42]。PD-1/PD-L1途径可能对脓毒症起重要调控作用。在脓毒症发生过程中，腹腔巨噬细胞表达高水平PD-1，这与巨噬细胞失能相关。清除PD-1髓系敲除小鼠体内的巨噬细胞后，小鼠抗菌能力减弱，炎症因子增多，致死率升高。PD-1可能不仅是巨噬细胞失能的标志，也可能是调节固有免疫反应的重要靶点[33]。

6 小结

PD-1作为重要的免疫抑制分子，不仅在T、B淋巴细胞发挥功能，还在固有免疫细胞——巨噬细胞上有一定表达。高表达PD-1的巨噬细胞与肿瘤发生、细胞凋亡及炎症发生息息相关。巨噬细胞上PD-1分子的表达及功能研究表明PD-1在固有免疫中也具有重要调控作用，为课题组针对免疫检查点的治疗提供了广泛且具体的思路。