外泌体的分离鉴定和生物学功能研究进展

霍彩云，霍 华，唐玉玲，郭晓桐，杨光辉，李颖鑫，王书扬，胡艳欣

(1.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193；2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 海淀 100097；3.吕梁市中心医院，山西 吕梁 033000)

外泌体是指由磷脂双分子层膜包裹蛋白质、脂质和核酸形成的囊泡结构，可以由几乎所有种类的细胞分泌，并存在于各种体液之中，包括血液、尿液、唾液、乳汁、羊水、恶性肿瘤、腹水等，是细胞间信号运输的主要载体[1]。近年来，由于其独特的生物学功能，使外泌体被越来越多的科学家关注，并且常被用于肿瘤诊断的早期检测标志物和疾病的临床治疗中。本文从外泌体的分离鉴定、生物学功能以及在疾病中的临床应用等方面加以综述，以期为外泌体在临床中的诊断和治疗提供参考依据。

1 分离

目前对外泌体的分离主要采用4种方法，包括分级超速离心法、梯度密度离心法、超滤法和使用试剂盒提取。其中，分级超速离心法是分离高纯度外泌体的经典方法，具有操作简单、技术难度低等优势。由于活细胞释放多样的胞外囊泡，例如外泌体、微泡或凋亡小体等，其具有不同的结构和生物学特性[2]。外泌体直径约为50～100 nm，微囊泡尺寸直径约为100～1 000 nm，凋亡细胞所释放的凋亡小体直径约为50～1 000 nm，通常可通过分级超速离心法将这些尺寸不等的囊泡分离出。当离心力为2 000 g时可分离出大的囊泡，而离心力为100 000 g 时即分离出尺寸小于150 nm的囊泡，可称为外泌体。然而，有文献证实这些尺寸小于150 nm的囊泡不仅是外泌体，还包括其他的囊泡[3]。梯度密度离心法、超滤法也经常用于外泌体的提取，但是其纯度较超速离心法低。然而，这3种方法均对样本的需求量大且提取过程中外泌体的损失量较多，对于如血清等稀少样品而言，存在一定的缺陷。随着技术的进步，外泌体抽提试剂盒被用于样品的外泌体分离中，尤其适用于稀少样本或外泌体分泌量少的样本。该试剂盒通常基于聚合物沉淀法，原理是体积排阻的聚合物通过夺取水分子使外泌体溶解度降低，进而在低速离心条件下发生沉降。尽管该方法具有快速、灵敏、节约样本和产量高等优点，但因其得到的外泌体纯度低而影响了外泌体功能等研究结果的可信度。因此，这4种方法各有利弊，在实际中应根据试验要求选用合适的提取方法，以期分离到高纯度的外泌体。

2 鉴定

外泌体鉴定可分为3个层面：形态学特征、蛋白标志物、粒径和浓度。首先，外泌体的鉴定可通过电镜法来进行形态学观察。在普通透射电镜下，外泌体多位于细胞外周并呈典型的扁平球状圆形膜性囊泡结构，其粒子大小和部分形态结构与流感病毒极其相似[4-5]。近年来，冷冻电镜技术也常被用于囊泡的形态学研究中，该方法是在普通透射电镜上加装样品冷冻设备，应用冷冻固定术将样品冷却到液氮温度，用于观察蛋白、生物切片等对温度敏感的样品，可以降低电子束对样品的损伤，减小样品的形变，从而得到更加真实的样品形貌。该方法不仅可观察囊泡的外部结构、细胞膜和内腔，还可清晰地观察脂质双分子层和囊泡内部结构。已有研究通过该方法证实了单一类型细胞分泌的外泌体具有形态多样性，发现人源肥大细胞释放的外泌体在冷冻电镜下呈现多种不同的形态特征，根据其形态差异可将其分为9个亚群，例如含脂质双分子层的圆形的单一囊泡、大囊泡内和小囊泡共存的圆形或略长方形的双囊泡和含脂质双分子层的细长的管状囊泡等，而这些不同亚群具有不同的功能和理化性质[6]。

此外，外泌体的进一步鉴定可通过Western Blot技术加以辅助。外泌体包含的蛋白质成分具有多样性，很大程度上取决于其来源的细胞种类。由于维持外泌体生物发生、结构及功能的蛋白质组成具有保守性，包括生物大分子运输所需的内含体分选转运复合体的组成蛋白Alix和TSG101、四跨膜蛋白超家族的CD63、CD9和CD81等，这些蛋白在外泌体中具有较高的丰度，常被用作研究外泌体的特异性标志物[7-8]。

近年来，纳米颗粒追踪分析(NTA)技术也被用于外泌体的表征鉴定。该技术旨在对10～2 000 nm范围内的纳米颗粒进行快速实时动态检测，测量参数包括颗粒粒径、散射光强、浓度等。纳米颗粒跟踪分析仪的光束用于照射外泌体样品中的颗粒，其摄像头能够捕捉布朗运动下移动颗粒的视频文件，并通过分析技术软件单独追踪多个颗粒并利用爱因斯坦方程式计算颗粒浓度和粒度分布。相比于其他表征方式，NTA技术不破坏外泌体原始状态，并且可搭配相应滤光片用于测量荧光抗体(如CD9,CD63,CD81等)标记的外泌体来确定外泌体纯度，而且具有检测速度快的特点。有研究利用该技术成功的发现细胞外囊泡在机体内的分布依赖于细胞类型、人为注射囊泡的方式和剂量以及靶器官等因素[9]。

3 生物学功能

外泌体承担着细胞间通讯分子的角色，携带着多种蛋白质、核酸和脂质等信息物质，广泛参与了细胞间物质和信息的传递，在细胞间交流、免疫应答及肿瘤发生、发展等生理和病理过程中起重要的作用。外泌体经胞吐方式分泌后，其携带物质可影响局部微环境或通过体液循环在远离母细胞的部位发挥作用[10]。外泌体作用于靶细胞参与细胞间信息传递主要有3种方式：一是外泌体上特殊的表面蛋白可与靶细胞的受体结合，而不需要被靶细胞摄取，进行跨膜信号的传导(如抗原呈递的过程)；二是与细胞膜融合，携带的蛋白质和核酸被转运至靶细胞内；三是以胞吞形式被摄取。当进入靶细胞后，外泌体所携带的信息物质发挥其重要功能，外泌体中的mRNA进入到靶细胞后，能利用靶细胞的蛋白质翻译系统，翻译成相应蛋白，从而调控靶细胞的功能。研究表明，结肠直肠癌细胞分泌的外泌体含细胞周期相关的mRNA，可促进内皮细胞的增殖，进而促进肿瘤的生长和转移，并在局部和远处的转移位点形成有利于转移和侵袭的细胞微环境[11-12]。除此之外，利用二代测序等技术发现，外泌体中还包含了小分子RNA(microRNA)、长链非编码RNA (IncRNA)、线粒体DNA (mtDNA)、双链DNA (dsDNA)、基因组DNA (gDNA) 和环状RNA (cirRNA)等特殊核酸，对靶细胞的基因表达和生物学功能起到调控作用[13-15]。例如，肝细胞癌来源的外泌体miR-21促进成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞(CAF)的转化，活化的CAF通过分泌血管生成细胞因子进一步促进肿瘤进展[16]。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中促进肿瘤进展的主要参与者和协调者，可极化为M1型或M2型巨噬细胞，研究发现，M2型巨噬细胞衍生的外泌体高表达的miR-21-5p 和miR-155-5可介导结直肠癌细胞的迁移和侵袭[17]。最新研究表明，巨噬细胞衍生的外泌体可将miR-223这种microRNA递送至卵巢癌细胞，通过miR-223/PTEN-PI3K/AKT信号传导途径引起肿瘤细胞化疗耐药性[18]。cirRNA被认为是肿瘤发展的关键因子，有研究发现，高转移性肝癌细胞可通过分泌含有circCPTGR1的外泌体来促进较低转移或无转移潜能细胞的转移侵袭能力[19]。

不同类型细胞分泌的外泌体中蛋白质的种类也存在差异，例如人类树突状细胞(Dendritic cells,DC细胞)产生的外泌体含有主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)I类和II类分子，这类分子与外源性抗原的肽段结合，使T淋巴细胞有效活化，从而诱导T淋巴细胞的免疫应答，在免疫调节中发挥重要作用[20]。最新研究发现，外泌体介导的干扰素诱导跨膜蛋白IFITM2向树突状细胞的传递抑制了IFNα途径的活化并阻断外源IFNα的抗慢性乙型肝炎功效[21]。

在一些病毒感染过程中，外泌体可以携带病毒的核酸、蛋白质甚至整个病毒粒子，产生影响靶细胞生长，增强靶细胞的易感性，创造有利于病毒感染的微环境等效应。有的病毒可以让外泌体携带病毒需要的细胞表面受体，增加易感细胞的类型，扩大病毒的感染范围。如肝癌感染的细胞具有针对性，需要宿主细胞上存在特异的受体(CD4分子和辅助受体CXCR4或CCR5)，外泌体可以携带来自宿主细胞的CXCR4或CCR5，将其传递给受体阴性的细胞，使其产生易感性，最终促进小鼠肝癌细胞的迁移、侵袭和淋巴管的生成[22]。在丙肝病毒(Hepatitis C virus,HCV)的研究中发现，HCV可以留存在晚期胞内体的腔内囊泡中，并通过外泌体直接将整个病毒粒子或病毒的RNA和蛋白递送至临近的细胞来扩大感染[23-24]。

4 外泌体在疾病中的应用

作为细胞间物质或信息交流的重要载体，外泌体因其独特的生物学结构和功能被广泛的应用于疾病的诊断和治疗中。外泌体携带有生物信息物质，可以作为一种生物标志物，用于心血管疾病、肾脏疾病、中枢神经系统疾病和癌症的早期筛查以及诊断中。其中，外泌体在实体肿瘤领域研究比较广泛。相比正常细胞，肿瘤细胞可分泌更多的外泌体，并且缺氧微环境促进肿瘤细胞的外泌体释放和诱导促血管生成微囊泡的脱落增加[25]。在癌症的早期检测中，肿瘤衍生的外泌体携带有肿瘤特定的蛋白质，有助于肿瘤的筛选和诊断。在某些癌症(如结肠直肠癌、胰腺癌和卵巢癌)中，外泌体中肿瘤相关性蛋白性生物标志物的类型和表达水平与癌症类别的存在和进展密切相关，研究证明肠道间质瘤分泌的外泌体富含丰富的诊断标志，如CD34和ENG等[26-27]。由于外泌体具有体积小、含脂质双分子层结构、良好的生物相容性、可通过血脑屏障等优点，使其成为先进药物递送和治疗的新一代内源性纳米材料[28]。例如在肿瘤治疗中，针对特定癌症类型的癌细胞的表面受体，设计高亲和的配体来修饰装载了药物的外泌体，能达到靶向递药的效果[29]。在组织损伤和修复过程中，外泌体也发挥关键性作用。干细胞及其分泌的外泌体在促进骨再生方面具有相似的作用，有研究者发现，脐带间充质干细胞来源的外泌体可通过缺氧诱导因子(HIF)-1α介导的血管生成促进大鼠骨折愈合[30]。

5 展望

外泌体不仅是细胞分泌的内容物，同时也代表了一种复杂的胞内处理特异性分子的方式，已逐渐成为疾病相关研究的热点。由于独特的生物学特性和在体内的广泛分布，使外泌体成为用于疾病诊断和治疗的有力“武器”，在相关临床诊断中具备广阔的应用前景。然而，外泌体的分子机制、检测和治疗方法还需进一步研究。例如，临床中用以准确快速区分外泌体和其他囊泡的平台仍未健全，在未来研究中仍需探索新型高度灵敏地鉴定不同种类囊泡的方法。此外，研究能够提取大量外泌体的新策略、提高外泌体靶向给药的效率等依然是外泌体用于癌症诊断和治疗领域亟待解决的问题。随着外泌体的不断深入研究，我们相信其在疾病诊断和治疗中将有着广阔的发展前景。