生物样品中芬太尼类物质检测技术研究进展

韦棋，苏福海

(中国计量科学研究院，北京 100029)

芬太尼作为麻醉辅助用药，因其具有起效快，持续时间短，镇痛作用强等特点，自上个世纪60 年代以来，被广泛应用于外科手术中。但作为一种阿片类药物，芬太尼可以激活人体内的阿片受体，具有兴奋和刺激作用，有较强的成瘾性和耐受性。由于其具有类似海洛因的作用，作为药品的芬太尼在一些国家被用于吸毒，芬太尼滥用现象也随之出现。早在1964 年，联合国毒品和犯罪问题办公室就将其列为国际管制药品。2019 年4 月1 日，我国发布了关于将芬太尼类物质列入《非药用类麻醉药品和精神药品管制品种增补目录》的公告，将25 种芬太尼类物质列为管制药品。目前芬太尼滥用现象已成为世界性的公共卫生问题，芬太尼的滥用不仅会对人体造成伤害，甚至会导致死亡，成人致死剂量仅为几毫克［1］。从1970 年代卡芬太尼进入市场，至2010年，仅发生了几起芬太尼类物质滥用事件，但2013年至2014 年，与芬太尼类物质相关的死亡人数增长了426%［2］。至2015 年，据美国疾病控制中心的报告，在33 091 例阿片类药物死亡中，约有30%是由于芬太尼类物质造成的［3］。芬太尼滥用现象屡禁不止的原因之一在于芬太尼类物质人工合成方法简单便捷，通过对芬太尼结构中的苯基烷基、丙酰基，尤其是4-哌啶基环进行修饰，可以衍生出许多新的芬太尼类似物，这些物质大多保留了芬太尼的原有效力或者药效更强［4］。其中应用较普遍的有呋喃基芬太尼、β-羟基硫代芬太尼和戊酰基芬太尼等［5］。截至2016 年底，我国共出现了66 种芬太尼类物质［6］。此外芬太尼类物质药效比海洛因强，但价格低廉，用量小，便于运输，这些特点使其成为了新一代新型精神活性物质。因此建立高灵敏度、高选择性和高准确度的芬太尼类物质分析检测方法具有重要意义。笔者对近年来生物样品中芬太尼类物质检测技术研究进展进行综述，旨在为生物样品中芬太尼类物质检测技术相关研究提供参考。

1 检测方法

1.1 液相色谱–质谱联用(LC–MS)法

LC–MS 法具有高灵敏度、高通量、分析速度快、应用范围广等特点，可以对生物基质中芬太尼类物质及其代谢物同时进行检测分析。芬太尼类物质极性强，挥发度低，相对分子质量大，具有热不稳定性，是较复杂的分析体系，因而LC–MS 法成为当今研究芬太尼类物质应用较普遍的分析方法。

FERNÁNDEZ 等［7］建立了超高效液相色谱–串联质谱法分析头发中16 种合成阿片类药物。头发样品经二氯甲烷、甲醇和水洗涤，室温下干燥后剪成长度为1 cm 的碎屑，用球磨机研磨成粉末，加入16 ng／mL 的芬太尼-d5 内标溶液25 mL 与1 mL 甲醇，将样品溶液在45℃下孵育4 h，然后在14 000 r／min 下离心10 min，收集上清液，浓缩至约100 μL，加入0.1 mol／L 的乙酸钠缓冲溶液2.5 mL，通过固相萃取法萃取样品，萃取柱用1.0 mL 甲醇，1.0 mL 水和1.0 mL 0.1 mol／L 乙酸钠缓冲溶液(pH=4.0)预处理，上样后，用1 mL 0.1 mol／L 盐酸和1 mL 甲醇洗涤，以消除潜在的干扰，最后用1.0 mL 甲醇–氨水溶液(体积比为95∶5)洗脱，收集洗脱液并浓缩至300 μL 进样分析。该方法首次在头发样品中定量检测出了AH–7921、丙烯芬太尼、巴豆酰芬太尼、U-49900、戊酰芬太尼、4-氟异丁酰芬太尼、四氢呋喃芬太尼，样品提取效率大于74%。SALOMONE 等［8］建立了一种简单、快速、高特异性和高灵敏度的UHPLC–MS／MS 分析34 个头发样品的方法，检测出13 种合成阿片类物质(包括芬太尼类似物)及其代谢物。该方法基质效应小，选择性较好，检出限为0.1～1.5 pg／mg，定量限为0.3～4.5 pg／mg，方法灵敏度较高。在该项研究中，研究人员还在芬太尼和呋喃基–芬太尼阳性样品中检测出4-苯胺基-N-苯乙基哌啶(4-ANPP)，首次证明了4-ANPP 可以被选作芬太尼类似物的标记物，研究人员指出，4-ANPP 与去甲芬太尼的比例将有助于推测分析对象服用芬太尼类物质的情况。

ADAMOWICZ 等［9］开发了一种液相色谱–串联质谱方法，用于快速、灵敏地检测全血中的芬太尼类似物及其它新的合成类阿片受体激动剂，可以对43 种阿片类药物(包括38 种芬太尼类物质)进行快速定性筛选分析。该方法采用核–壳型颗粒色谱柱，通过梯度洗脱程序，所有分析物在13 min内实现了分离，基于动态多反应监测模式(MRM)，共监测了132 个MRM 离子对，大多数化合物的保留时间均可以很好地区分，选择性较好，检出限为0.01～0.20 ng／mL，灵敏度较高，不足之处在于该方法无法实现对某些异构体的分离。STRAYER 等［10］采用固相萃取法萃取样品，以3.0 mL 甲醇，3.0 mL水和4.0 mL 磷酸缓冲盐溶液(pH=6.0)预处理萃取柱，将校准样、对照品和样品用3.0 mL 水、1.0 mL 1.0 mol／L 乙酸和3.0 mL 甲醇洗涤，以消除潜在的干扰，最后用3.0 mL 二氯甲烷–异丙醇–氢氧化铵(体积比为78∶20∶2)溶液洗脱，收集洗脱液，于40℃空气流中蒸发干燥，加入100.0 μL 甲醇复溶，然后采用LC–MS／MS 进行分析。该方法操作便捷，分离速度快，回收率较高，在低、中、高3 个加标浓度水平时的回收率分别为(84±19)%、(78±12)%和(94±4.1)%。QIN 等［11］将100 μL 全血样品与10 μL 质量浓度为100 ng／mL 的IS 溶液(芬太尼-d5和诺芬太尼-d5 的甲醇溶液)混合均匀，涡旋振荡15 s 后，分别加入0.7 mL 乙酸乙酯和100 μL 缓冲液(pH=9.2)，涡旋30 s，然后离心5 min，收集有机层，并于40℃空气流中蒸发干燥，涡旋振荡并离心后，加入200.0 μL MPA 溶液(20 mmol／L 乙酸铵溶液、5%乙腈溶液和0.1%甲酸溶液的混合溶液)复溶，将上清液直接注入UPLC–MS／MS 系统进行分析。该方法采用液–液萃取法提取净化血液样品，样品制备简单快速，价格相对低廉，运行时间快(8min)，所需全血量较少(约100 μL)，检出限为0.005 ng／mL。

WANG 等［12］采用液相色谱–常压电离串联质谱法分析人类尿液中的13 种芬太尼类物质和2 种代谢物，该方法采用固相萃取法萃取尿液样品，采用6 种同位素标记的内标物，方法检测限为3～27 pg／mL，具有良好的准确度和精密度，可用于快速，灵敏地筛查人类尿液中芬太尼及其代谢物。PATTON 等［13］采用LC–MS／MS 法测定人类尿液中乙酰基去甲芬太尼，该方法将SPE 与LC–MS／MS 耦合，先用β-葡萄糖醛酸苷酶处理分析物，然后用310 μL 含有β-葡萄糖醛酸苷酶的浓度为0.1 mol／L 的乙酸钠缓冲溶液(pH=5.0)稀释尿液样品，加入10 μL 内标溶液，并于37℃下孵育60 min。将混合溶液加载到Strata-X 33u 聚合物强阳离子交换固相萃取柱上(30 mg／3 mL)，并用1 mL 浓度为0.1%的甲酸水溶液和1 mL 水–甲醇溶液(体积比为70∶30)洗涤，用0.5 mL 碱性甲醇–乙腈溶液(体积比为50∶50，含有2%氢氧化铵)洗脱2 次，收集洗脱液，并于60℃氮气流中蒸发干燥，然后将分析物用混合溶液重新溶解，进样分析，混合溶液由A、B 两组分组成（体积比为1∶1），A 为含有85%的10 mmol／L 甲酸铵水溶液和15%的含有0.1%甲酸的甲醇溶液，B 为乙腈。该方法线性关系良好 (r2＞0.99)，精密度较高(RSD ＜5%)，但检测限较高，仅达到1 ng／mL，灵敏度较低。

CRAIG 等［14］采用LC–MS／MS 法测定干血点中13 种芬太尼类物质和4 种代谢物。该方法样品制备简单，易于检测新出现的芬太尼类物质，可用于现场快速检测。KAHL 等［15］采用超高效液相色谱–串联质谱法分析生物体液和组织中的芬太尼类物质。在均质的肝和脑组织中加入4 mL 浓度为0.1 mol／L 的磷酸钠缓冲溶液(pH=6.0)和50 μL 浓度为80 ng／mL 的内标溶液(β-羟基硫代芬太尼-d5、乙酰芬太尼-c6、芬太尼-d5、呋喃芬太尼-d5 和丁芬太尼-d5)，将样品溶液涡旋，静置，离心后通过正压固相萃取法萃取样品，将色谱柱用3 mL 甲醇、3 mL去离子水和1 mL 浓度为0.1 mol／L 的磷酸钠缓冲液(pH=6)预处理，取上清液上样。然后用3 mL 去离子水和1 mL 浓度为1 mol／L 的乙酸冲洗，以消除潜在的干扰，并在0.8 MPa 下干燥5 min。然后用2 mL 己烷、2 mL 己烷–乙酸乙酯溶液(体积比为50∶50)和3 mL 甲醇冲洗，并在0.8 MPa 下干燥3 min。最后用3 mL 二氯甲烷–异丙醇–氢氧化铵(体积比为78∶20∶2)混合溶液洗脱，收集洗脱液，于40℃氮气流中蒸发干燥，加入50 μL 的0.1%甲酸水溶液复溶，注入UHPLC–MS／MS 分析。该方法准确度和精密度符合分析要求，特异性高，可以鉴别出对异丁酰基／丁酰基芬太尼和对氟异丁酰基／对氟丁酰基芬太尼等异构体，适用于法医毒理学领域的筛选分析。

1.2 气相色谱质谱联用(GC–MS)法

GC–MS 法因其高灵敏度，高分辨率，高选择性特点，已成为法医毒理学和兴奋剂分析中鉴定精神药物的重要分析方法之一。采用GC–MS 方法测定高沸点，具有热不稳定性和腐蚀性的芬太尼类物质时，样品需要进行衍生化等前处理，操作繁琐，不利于快速检测，且可能存在假阴性或假阳性结果，因此在实际应用中应注意对可疑样品进行进一步确认。

STRANO 等［16］采用GC–MS 法同时检测人体尿液中芬太尼类物质及其代谢物，采用短气相色谱柱在6 min 内即可完成色谱分离，采用SIM 数据采集模式，结果准确度和重复性较好(RSD ＜15%)，分析成本低。但芬太尼类物质检测限高达2 ng／mL，灵敏度较低，实际应用中可能会存在漏检的情况。

1.3 免疫分析法

免疫化学分析法是用于筛选生物样品中滥用药物的常用方法，包括酶联免疫吸附分析法(ELISA)、酶免疫试验法(EMIT)、荧光偏振免疫测定法等。免疫化学分析法是根据抗原和抗体的特异性结合进行测定，用以检测不同类别的分析物，分析成本较高。由于某些芬太尼类似物或代谢物可能无法与免疫分析法发生交叉反应，从而无法鉴定出某些芬太尼类似物抗体数量，使其应用受到限制［17］。此外免疫分析法不能提供有关分析物的结构信息，还有可能会导致假阳性结果，因此随着其它高灵敏度仪器的出现与发展，光谱技术联用如GC–MS 和LC–MS 等方法已经逐渐取代免疫分析方法。

WANG 等［18］采用自动均相酶联免疫测定分析法，对来自急诊科患者的尿液样品进行了筛选分析，并采用LC–HRMS 对阳性样品进行定性分析，使用LC–MS／MS 进行定量分析。结果发现，乙酰芬太尼、利培酮和9-羟基利培酮与芬太尼免疫测定法发生交叉反应，免疫测定法对部分尿液的诊断敏感性为100%，但观察到7 个假阳性样品，因此特异性仅为86%。应用免疫化学分析法，应对所有筛查呈阳性的样品进行确认试验。

1.4 其它方法

KAMMER 等［19］建立了基于适体的FSA–CIR方法，结合高亲和力的DNA 适体探针，实现高灵敏度定量检测阿片类药物。FSA 的独特之处在于它对基质不敏感，可减少基质干扰；CIR 的优点在于可以同时测量测试样品和参比样品，可提高通量以及干涉仪的独特功能。结果显示，采用FSA–CIR 法测定阿片类物质的定量限比LC–MS／MS 法高5 至275 倍，比EMIT 法高约50 至1 000 倍。该方法仪器体积小，灵敏度高，分析速度快，可实现药代动力学分析，可在样品浓度低时以高灵敏度、无创地快速定量检测阿片类药物。MISHRA 等［20］采用穿戴式微针传感器阵列，在单个贴片平台上以微创方式对阿片类药物和有机磷酸酯神经毒剂进行连续电化学检测，该方法能够通过基于纳米材料的多层表面结构连续监测芬太尼直至纳摩尔水平，不仅可以检测芬太尼，还可以检测其代谢产物(主要是去甲芬太尼)。同时基于其独特的氧化还原特性并根据不同的电位来测量吗啡和去甲芬太尼，可用于吗啡和阿片类药物的筛选，具有高灵敏度、高选择性和良好的稳定性。

2 生物检材

2.1 头发

头发是一种常用的生物检材，具有采集方便，容易保存，检测窗口长和无损非侵入性等特点。血液分析和尿液分析可提供与药物成瘾有关的短期信息，而长期的病史需要通过头发分析来追溯。头发分析可提供药物成瘾史或药物毒性的相关信息，对于新的精神活性物质的分析，头发测试是尿液测试的良好辅助［21］。给药后，药物会通过各种机制沉积在头发中，与其它生物样品相比，沉积的药物非常稳定，可以在更长的时间后进行检测。此外分段分析可以通过利用敏感的分析技术反映给药时间和给药情况，包括多次或单次给药，单独或同时服用某些药物。但药物沉积的机制受到许多因素的影响，如头发色素沉着与沉积的药物浓度之间存在联系。研究表明，黑发的药物浓度最高，而白发的药物浓度最低。药物的沉积情况还与其结构有关，研究人员采用荧光显微镜研究药物与头发的结合力，发现带负电荷的药物，如四氢大麻酸(THC–COOH)很难进入头发中［22］。尽管药物在头发中非常稳定，但进行染发烫发等头发护理可能会影响测定结果［23］，头发的清洁程度也会影响检测结果的准确度。由于受到个体差异，如头发生长周期及速度不同，头发采集部位、药物代谢等因素的影响也会导致检测结果重现性较差，而且以头发作为样品进行分析时还存在药物提取较复杂、耗时长、分析成本高等缺点。

2.2 血液

血液样品常用于检测分析芬太尼类物质的含量，具有检测技术成熟、血浆中药物浓度较大且较恒定、结果准确度和精密度高等优点。但血液检测的影响因素较多，如采样、血液的保存、基质干扰等，因此对实验人员的操作技术、样品前处理技术和仪器的灵敏度等要求较高。

2.3 尿液

由于具有准确性和可靠性高、无损及非侵入性、分析成本低等特点，使得尿液检测成为分析阿片类药物的常用分析方法之一［24］。PALAMAR［25］通过对532 名过去一个月使用过海洛因或阿片类药物的成年人进行尿液测试和头发测试，发现虽然头发检测的检测窗口更宽，检测时限更长，但短期内尿液检测的效果更好。在戒毒过程中，监控方式之一是对戒毒人员定期进行尿液检测。研究表明，在尿液样本中对芬太尼类物质的代谢物进行检测分析，可以延长检测时间至暴露后96 h，延长尿液检测的检测时限，可以增加对真实暴露样本的阳性识别率［26］。但由于芬太尼类物质结构相似，代谢途径相同，许多芬太尼类物质具有相同的代谢物，如去甲芬太尼是α-甲基芬太尼、β-羟基硫代芬太尼和芬太尼的代谢产物［27–28］，因此对代谢物的检测并不能确定母体药物，给芬太尼类物质的分析鉴定带来了一定挑战。

2.4 其它检材

芬太尼类物质检测常用的生物检材还有干血点和组织等。干血点分析可以简化分析步骤，不需要对样品进行前处理［29］，可以对极少量样品进行分析，具有分析物稳定，样品储存简单，运输方便，分析过程中无感染风险等特点，但对分析仪器和检测方法的灵敏度要求较高。

生物样品成分复杂，干扰物众多，生物样品中芬太尼类物质的定性和定量分析存在较大困难，单一的分析检测方法已无法满足检测要求，需要采用多种仪器综合分析和各种联用技术分析。检测人体中的芬太尼类物质可以通过血液、尿液、头发和组织等进行检测。单一的生物检材不能提供全面的信息，实际应用中需要结合各种不同的生物检材进行分析，才能获取准确可靠的信息。由于芬太尼类物质的低剂量、高效能特点，生物基质中芬太尼类物质浓度普遍较低，从而对分析检测方法的灵敏度提出了挑战，一般检出限要求低于1 ng／mL，通常低于0.1 ng／mL［30］，要求分析检测方法具有高灵敏度。此外“芬太尼家族”的不断更新，出现了许多结构相似的类似物和结构异构体，给芬太尼类物质的鉴别和定量分析带来了严峻的挑战，要求相关的分析检测方法必须灵活且定时更新，具有高分辨率和高特异性以区别各种芬太尼类似物及其异构体。

3 展望

3.1 样品前处理技术发展

样品前处理是生物样品中芬太尼类物质分析中的重要步骤，也是分析过程中最耗时耗力的环节之一。生物样品中芬太尼类物质分析的前处理技术一般采用固相萃取、液液萃取、蛋白沉淀等传统方法，处理过程繁琐费时，需用大量有机溶剂，存在安全隐患，且污染环境。样品前处理技术未来发展趋势主要集中在实现样品前处理过程的自动化和减少样品和溶剂的用量，以提高分析速度，避免操作失误，减少环境污染，降低分析成本。近年来，人们开发了许多新的萃取技术以取代传统的萃取方法，如固相微萃取法、液相微萃取法、微珠萃取法、半微量液–液萃取法、分散固相萃取法(dSPE)、盐析辅助液–液萃取法(SALLE)、分散液–液微萃取(DLLME)法、超临界流体萃取法、磁性纳米颗粒、分子印迹聚合物等新型处理技术［31–35］。这些方法具有自动化程度高、分析速度快、有机溶剂用量少、对环境友好等优点，有望成为未来研究生物样品中芬太尼类物质的新型样品前处理技术。

3.2 检测技术发展

多种仪器结合和各种联用技术综合分析是生物样品中芬太尼类物质分析的新趋势。质谱因其高分辨率，高选择性的特点，是法医毒理学和兴奋剂分析中鉴定违禁药物的重要分析工具之一。质谱仪与气相色谱、液相色谱等仪器联用，如GC–MS，LC–MS，MS／MS，CE–MS 和FTIR–MS 等，用于分离和检测复杂化合物的各种组分，具有强大的分离和定性定量能力，在毒品分析检测方面具有极大的优势。其中MS／MS 将多个质谱串联在一起，充分利用质谱的分离与分析功能，可以简化试样的预处理过程，适于分析复杂化合物，定量分析多个化合物，在检测生物样品中的违禁药物方面具有极大的优越性。MS／MS 多与GC 和LC 联用，GC–MS／MS 和LC–MS／MS 具有高灵敏度和高特异性，对芬太尼类物质的分析检测具有独特优势。随着科学技术的不断发展，GC–MS／MS 和LC–MS／MS 与SPME 等新型样品制备技术相结合，将在芬太尼类物质的分析中发挥更大的作用。

此外，传统的分析检测方法一般只适用于实验室分析，难以实现现场快速检测和原位实时分析，需要深入研究新型便携式分析仪器，加快其向便携式、微型化、经济化、智能化发展，以适应现场分析的发展趋势。SARAH［36］将碳和氯化银电极丝网印刷到聚对苯二甲酸乙二醇酯上，用离子液体处理碳电极，开发了一种电化学传感器现场检测芬太尼的方法，该方法仅需1 min 即可识别出芬太尼药物。此外ABRAHAMSSON［37］开发了磁悬浮法(MagLev)，可以实现阿片类物质的快速分析，该装置能够根据密度分离违禁药物(可卡因、甲基苯丙胺、海洛因、芬太尼及其类似物)，掺假剂和稀释剂的粉末混合物，并可以鉴定各成分，样品量低至50 mg。该装置具有便携式和操作简便的特点，分离迅速，与FTIR–ATR、拉曼光谱或质谱法联用，可提高其灵敏度和定性能力。MORATO［38］开发了一种新的接触喷雾质谱法测定溶液中的30 种违禁药物，利用单个基材进行样品收集和直接分析，无需样品预处理即可分析液体样品，分析时间小于2 min，样品量低至10 μL，具有灵敏度较高以及无创的特点，未来有望应用于临床或法医环境中的即时检测。