适应性免疫细胞在自身免疫性溶血性贫血发病机制中的研究进展①

阎羽欣 陈广洁

(上海交通大学医学院免疫学与微生物学系，上海 200025)

自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia,AIHA)是由机体免疫调控异常、免疫调节紊乱等因素引起自身抗体和(或)补体作用于红细胞膜，导致红细胞破坏的溶血性贫血。作为一种自身免疫性疾病，适应性免疫细胞在其发病机制中发挥重要作用。随着相关研究的不断推进，适应性免疫细胞亚群与AIHA发病机制的关系逐渐明确。

适应性免疫应答的成分为淋巴细胞及其产物。具有特异性应答能力的淋巴细胞分为B淋巴细胞和T淋巴细胞两类，前者又称为B细胞，后者又称为T细胞。

1 B淋巴细胞在AIHA发病机制中的作用

1.1B1-a细胞和B2细胞在AIHA发病机制中的作用 根据B细胞不同的发育来源，可将B细胞分为B1细胞和B2细胞。根据是否表达CD5-分子，又可将B1细胞分为CD5+的B1-a细胞和CD5-的B1-b细胞[1]。B1细胞在个体发育胚胎期即产生，主要定居于腹膜腔、胸膜腔和肠道固有黏膜层中，产生低亲和力的IgM，参与固有免疫；B2细胞是参与适应性体液免疫的主要细胞，在抗原刺激和Th细胞的辅助下最终分化为抗体形成细胞——浆细胞。B1-b细胞在包括AIHA在内的自身免疫病的发病机制中的作用鲜有报道，本文主要讨论B1-a与B2细胞在AIHA发病机制中的作用。

CD5+的B细胞(B1-a细胞)是一类不需抗原提呈细胞辅助的，产生以IgM为主的低亲和力、多反应性抗体的B细胞亚群，在抵御外来微生物感染，维持机体内环境稳定等方面起重要作用。研究发现，未经治疗的(或初治组)AIHA患者外周血内CD5+B细胞与健康人或缓解组AIHA患者相比均显著增高[2,3]。CD5+B细胞的表面分子CD80、CD86的表达也显著增高[2,4]。CD5+IL-10+B细胞占B淋巴细胞的百分比与AIHA患者的血红蛋白、补体3(C3)水平呈负相关，与乳酸脱氢酶、总胆红素、间接胆红素水平呈正相关[3]。AIHA患者外周血内CD5+B细胞IL-10 mRNA表达水平升高，但CD5+B细胞分泌IL-10至外周血的能力下降，可能导致IL-10的免疫抑制功能不能充分发挥[2]。此外，有研究发现CD5+B淋巴细胞中CD5+TGF-β+B淋巴细胞比例和TGF-β的mRNA表达水平在新诊断和缓解AIHA方面与健康对照组之间的差异无统计学意义，说明CD5+B淋巴细胞可通过分泌IL-10而非TGF-β来调控AIHA患者的免疫应答[3]。化范例等[5]研究发现，AIHA患者外周血中B1-a细胞及B细胞占总淋巴细胞比例均明显升高，表明在AIHA患者中，不但B1-a细胞增加，B2细胞也有明显增加；患者在接受脾切除术，溶血得到控制后B1-a细胞明显下降。研究显示，4%～10%的慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)患者会发生自身免疫性血细胞减少症，而AIHA是最常见的自身免疫性血细胞减少症。CLL背景下的继发性自身免疫性血细胞减少症病因复杂，主要是由于非恶性B细胞产生多克隆高亲和力的IgG抗体，其针对红细胞和血小板上的抗原会分别导致溶血性贫血和免疫性血小板减少症[6,7]，而这种高亲和力的IgG抗体来源于B2细胞分化后的浆细胞。这些研究结果反映了B1-a细胞和B2细胞可通过过表达表面分子、分泌细胞因子以及产生IgM、IgG自身抗体等机制参与AIHA的发病。

关于B细胞尤其是B1-a细胞扩增的机制，研究发现，miR-150是一种在成熟、未活化的B细胞和T细胞中选择性表达的miRNA。miR-150最重要的作用靶点是转录因子c-Myb，而c-Myb对淋巴细胞发育和免疫应答至关重要。miR-150在体内控制c-Myb的表达，miR-150缺陷可导致B1细胞扩增和体液免疫应答增强[8]。Xing等[9]研究表明，AIHA患者体内CD19+B细胞中的c-Myb mRNA表达上调，而miR-150表达下调，证明了miR-150与c-Myb之间的负相关关系，表明在AIHA患者中，miR-150很可能通过影响转录因子c-Myb的表达从而调控B细胞的发育、分化和成熟，进一步影响自身抗体的生成和自身免疫反应。

除RNA水平的调节之外，B细胞活化因子(B-cell-activating factor,BAFF)在AIHA中的作用也受到广泛关注。BAFF是TNF超家族的一员，主要由髓细胞产生和分泌。BAFF在外周B细胞的产生、成熟及免疫球蛋白生成类别转换中都起到重要的调控作用。BAFF可通过MEK5-ERK5 MAP激酶信号通路诱导成熟B细胞存活和B2细胞数量的稳态维持[10]。Zhao等[11]研究发现，AIHA患者，尤其是直接抗人球蛋白试验(direct antiglobulin test,DAT)结果呈IgG(+)C3(+)的患者血清BAFF水平显著升高，提示以BAFF为靶点的靶向治疗在AIHA患者中具有潜在的应用价值。Xu等[12]研究发现，AIHA患者血清BAFF水平显著高于健康人，并且血红蛋白水平较低(血红蛋白<8 g/dl)和LDH活性较高(LDH>480 U/ml)的患者血清BAFF水平显著增加，而糖皮质激素治疗可以降低血清BAFF水平，因此血清BAFF水平可反映AIHA的临床活性。以上研究结果提示AIHA患者血清中BAFF上调可促进B细胞介导的自身免疫反应。

1.2调节性B细胞在AIHA发病机制中的作用 调节性B细胞(regulatory B cell,Breg)是近年来新发现的促进免疫耐受、具有免疫抑制功能的B细胞亚群。人类中已发现的Breg表型有CD24hiCD27+、CD19+CD24hiCD27int、CD19+CD24hiCD38hi、CD19+CD25hiCD71hi等。通过产生IL-10、TGF-β和IL-35等细胞因子，Breg细胞可抑制促炎性淋巴细胞的分化，例如产生肿瘤坏死因子α(TNF-α)的单核细胞、Th1细胞和细胞毒性CD8+T细胞等[13]。Breg细胞在系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等很多自身免疫病的发病机制中有重要作用[14]。研究表明，AIHA患者外周血中CD19+CD24hiCD27+Breg细胞的表达较健康对照组显著降低，AIHA患者外周血中分泌IL-10浓度与健康对照组相比亦显著降低[15]。朱奕等[16]研究发现，AIHA患者外周血单个核细胞中CD19+Tim-1+Breg细胞数量显著低于健康对照组，并且培养液上清中IL-10水平也低于健康对照组。这些研究结果均提示Breg细胞数量和分泌功能的下降可能与AIHA的发病机制相关。

2 T淋巴细胞在AIHA发病机制中的作用

根据功能的不同，T细胞可分为辅助T细胞(helper T cell,Th)、调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)和细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL/cytotoxic T cell,Tc)。

2.1Th细胞在AIHA发病机制中的作用 Th细胞均表达CD4，通常所称的CD4+T细胞即指Th细胞。未受抗原刺激的初始CD4+T细胞为Th0。在抗原性质和局部免疫微环境中细胞因子等因素的调控下，Th0分化成不同亚群，包括Th1、Th2、Th17和滤泡辅助T细胞(follicular helper T cell,Tfh)等。

2.1.1Th1细胞和Th2细胞在AIHA发病机制中的作用 Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、IL-17和GM-CSF等细胞因子，介导细胞免疫应答和迟发型超敏反应，在抗感染、器官移植排斥反应和自身免疫病诱导过程中有重要作用。Th1型细胞因子可促进CTL、自然杀伤细胞及巨噬细胞的活化和增殖，介导细胞毒效应。Hoyer等[17]实验表明，AIHA小鼠模型中存在Th1表型的CD4+T细胞扩增和过度的Th1免疫应答，而这种免疫应答在IFN-γ被去除后消除。IFN-γ促进调理性抗红细胞抗体的产生并刺激脾巨噬细胞的吞噬活性，促进AIHA的发生和发展。近期也有国内实验表明，与健康对照组相比，AIHA 患者外周血中CD4+IFN-γ+Th1 细胞比显著增高[18]。

Th2细胞主要分泌Th2型细胞因子，包括IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等。它们能促进Th2细胞的增殖，辅助B细胞活化，参与体液免疫反应，同时抑制Th1细胞增殖。既往实验表明，AIHA患者外周血内IL-4水平较健康对照组明显升高，推测Th2细胞与IL-4促进了AIHA的发病[19]。IL-33是新近发现的IL-1超家族的细胞因子，参与T细胞介导的免疫应答。Bu等[20]研究发现，AIHA患者外周血IL-33水平与健康对照组相比显著升高，IL-33水平与AIHA疾病活动度呈正相关。另外，IL-33可促进IgG型抗红细胞自身抗体的产生，其机制正是促进相关Th2型细胞因子IL-4、IL-6、IL-13的表达。除此之外，实验表明，与健康对照组相比，活动性温型AIHA患者外周血中存在Th1/Th2的不平衡、Th2细胞亚群的增加及IL-4与IL-10的表达增加，推测这种“Th2谱”促进了自身反应性B细胞克隆的诱导和增殖[21]。以上研究结果说明，Th1、Th2细胞数量、Th1/Th2比及两种细胞所分泌的细胞因子水平变化参与了AIHA的发病。

2.1.2Th17细胞在AIHA发病机制中的作用 随着免疫学研究的进展，多种不同于Th1和Th2的细胞亚群被发现，Th17细胞是其中一个重要的亚群。Th17主要产生IL-17、IL-21等细胞因子，介导炎症反应和自身免疫性疾病。Th17细胞可通过表达B细胞的化学趋化物CXCL-13，激活B细胞产生自身抗体。Xu等[22]研究发现，AIHA患者外周血中Th17比例显著增高且与疾病活动度呈正相关，可促进Th17分化和增殖的细胞因子IL-6与IL-21的表达水平在AIHA患者外周血中亦明显增高。另外，Th17的过继转移与IL-17均可诱导小鼠发生AIHA。Hall等[23]研究发现，AIHA患者血清中IL-17A的浓度与健康对照组相比显著升高，并与贫血程度相关。在AIHA患者外周血中，已鉴定出的特异性自身抗原介导了IL-17A对红细胞的免疫反应，而在健康供体的外周血单个核细胞中，IL-17A与红细胞不会发生免疫反应。徐文艳等[24]研究显示，AIHA溶血发作组患者CD3+CD4+IL-17+/CD3+CD4+细胞比例和CD3+CD4+IL-17+/T细胞比例均明显高于缓解组和健康对照者，提示Th17细胞的活化可能参与AIHA的发病。CD69与Gelectin-1可共同调控Th17细胞，AIHA溶血发作组患者CD4+T细胞内CD69 mRNA表达量显著高于缓解组及健康对照组，且溶血发作组患者血浆CD69水平显著高于健康对照组。以上实验结果均表明Th17及其分泌的细胞因子在AIHA的发病中起重要作用，并可能成为未来的治疗靶点。

2.1.3Tfh细胞在AIHA发病机制中的作用 Tfh细胞最主要的功能是在生发中心辅助B细胞分化为效应细胞，Tfh的作用需要其分泌的IL-21参与。方周宾等[25]研究表明，与健康对照组相比，AIHA患者外周血中CD4+T细胞中Tfh/Th比例显著升高，Treg/Th细胞比例显著降低，Tfh/Treg细胞的比例显著升高。另外，AIHA患者外周血中IL-21水平明显高于健康对照组，而IL-10的水平低于对照组。提示Tfh与Treg细胞比例失衡和相应的细胞因子分泌失调可能介导抗红细胞自身抗体的产生，从而参与AIHA的发病。刘艳等[26]的实验亦表明AIHA患者Tfh细胞比例明显高于正常对照组。这些结果提示有效抑制Tfh可能成为靶向治疗AIHA的新思路。

2.2Treg在AIHA发病机制中的作用 Treg细胞膜表面表达CD25、CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte-associatedantigen 4)，核内表达叉头盒蛋白 3 转录因子(forkhead/winged-helix transcription factor box P3，Foxp3)是Treg的重要的标记物之一，也是其发育和功能发挥的关键性转录因子[27]。Treg主要通过直接接触抑制靶细胞活化和分泌IL-10、TGF-β等细胞因子负调控免疫应答。黄东平等[28]研究发现，AIHA患者治疗前外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg较健康对照组显著降低，经糖皮质激素治疗后患者CD4+CD25+Foxp3+Treg比例较治疗前明显升高，较对照组也增高。黄继贤等[29]研究发现，CD4+CD25+Treg水平在AIHA发作患者中明显下降，差异具有统计学意义，且淋巴细胞共刺激因子CD86比率上升，推测明显上升的CD86可能进而导致Treg生成减少，最终参与AIHA的发病。值得注意的是，Richards等[30]研究表明，在小鼠体内，免疫系统对抗红细胞自身抗体的耐受与Treg不足并无直接关系，即Treg对于防止红细胞特异性的自身免疫反应的发生并不是必需的，表明机体对于抗红细胞自身抗体的耐受可能还存在其他免疫机制。

2.3CTL在AIHA发病机制中的作用 表达CD8分子的T细胞的主要功能亚群是CTL(Tc)。根据CTL分泌的细胞因子的不同，可以将其分为Tc1和Tc2两个亚群。其中Tc1主要产生IL-2、TGF-β、IFN-γ等细胞因子，介导CTL的细胞毒活性；而Tc2主要产生IL-4、IL-5、IL-10等细胞因子，参与对B细胞的辅助。既往研究表明，AIHA患者外周血中Tcl、Tc2细胞百分率无明显变化,与健康对照组比较差别无统计学意义，但Tcl/Tc2 比例明显升高，与对照组比较差别有统计学意义，提示AIHA患者体内Tc1细胞占优势，可能通过释放穿孔素、颗粒酶等方式特异性杀伤自体红细胞，导致溶血性贫血[31]。但新近实验显示，与对照组相比，AIHA患者中T细胞单克隆性的发生率显著升高，且分析显示单克隆T细胞属于CD8+亚群，但这种T细胞克隆的持续存在与血红蛋白水平和其他缓解或复发迹象无关，并且在治疗和临床改善后没有消失(观察期1～10年)，故推测 AIHA中T细胞克隆除对自身免疫过程有可能的致病作用外，并不直接参与溶血的维持和发展[32]。CTL在AIHA发病机制中的具体作用尚有争议，并未全面阐明。

3 小结

综上所述，B细胞与T细胞在AIHA的发病机制中均有重要作用。B细胞通过接受或不接受特异性抗原刺激产生抗体，攻击自身红细胞。B1-a细胞和B2细胞数量上升，介导了AIHA患者亢进的自身体液免疫反应。而具有免疫抑制功能的Breg数量减少，使机体免疫调节功能下降。T细胞中，Th细胞亚群及其分泌细胞因子的失衡参与了AIHA的发病，Tfh数量上升促进了效应B细胞的分化，Treg数量减少、功能下降导致免疫抑制功能降低，这些都是AIHA发病过程中的重要环节。AIHA发病机制中适应性免疫细胞的具体作用机制以及相关分子信号通路还未完全阐明，各细胞亚群的表面分子及细胞因子的表达水平变化还未有公认的结论，这些都可成为今后科学研究的方向。将B细胞和(或)T细胞的特定亚群或其分泌的细胞因子作为靶点的针对性治疗对于AIHA患者有积极意义，这也为今后科研工作带来新的启示。