三级淋巴结构在肿瘤中的研究进展①

温少迪 陈 云 沈 波

(南京医科大学附属肿瘤医院，江苏省肿瘤医院，江苏省肿瘤防治研究所，南京 210009)

随着人类寿命的延长，肿瘤日渐威胁人类健康，科学家对肿瘤发病机制、致病因素以及肿瘤治疗手段的研究也日渐深入，肿瘤的治疗手段从手术、化疗、放疗、靶向治疗进入到免疫治疗时代。虽然在临床治疗过程中有许多方案及药物可以选择，但不可避免地会出现耐药现象，且药物更新速度远低于肿瘤耐药的速度。多篇文献报道肿瘤根治的困难性、临床预后的转归及肿瘤的耐药性与肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)密切相关[1,2]。三级淋巴结构(tertiary lymphoid structures,TLS)是位于非典型淋巴器官部位的异位淋巴组织，存在于肿瘤、感染性疾病、自身免疫疾病和器官移植等慢性炎症组织周围，但慢性炎症部位形成的TLS不尽相同，发挥的功能也各有差异。在肿瘤中，TLS的形成象征免疫细胞的浸润及对肿瘤的杀伤作用的增强，是患者生存和预后的积极因素。但在某些其他病理生理情况下，TLS形成则会导致不良预后，如在移植物抗排斥反应中，免疫细胞浸润增多意味着对移植物的排斥和杀伤作用的增强，对移植物功能的发挥具有抑制作用。同样的情况在自身免疫性疾病中也存在[3]。本文主要探讨TLS在肿瘤中的作用，TLS是组成TME的重要因素，是肿瘤免疫应答的直接启动部位，可以更好地诱导T细胞启动，防止T细胞衰竭或无能，其密度对肿瘤的预后有预测作用[4]。此外，肿瘤的治疗对TLS也有一定影响。本文将对TLS的组成与结构、识别与检测、对预后的预测作用及治疗对TLS影响的相关研究进行综述。

1 TLS的组成与结构

1.1TLS的组成 TLS是异位淋巴细胞聚集形成的组织，有许多免疫细胞参与其组成，包括B细胞、滤泡状树突细胞(follicular dendritic cells，FDCs)、浆细胞、T细胞、树突状细胞(dendritic cells，DCs)、中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维网状细胞(fibroblastic reticular cells，FRCs)等。不同细胞在免疫组化中可以被不同的标记物染色，可用于对TLS的鉴定和识别。尽管对于最低有功能的TLS结构的定义尚不明确，但Silva-Sanchez等[5]将间质中的淋巴细胞聚集体(包括FDC,FRC,HEV)定义为TLS。事实上，TLS的发展经历了连续的成熟阶段。已经有文献对TLS的发育过程有了初步的定义，认为TLS可分为早期TLS、初级TLS及次级TLS。把含有高内皮小静脉(high endothelial venule，HEV)的TLS称为早期TLS，含有HEV及FDC的TLS称为初级TLS，含有HEV、FDC及生发中心(germinal center，GC)的TLS称为次级TLS。在肺鳞癌中，只有含有GC的次级TLS具有对预后的预测功能[6,7]。TLS与次级淋巴器官(secondary lymphoid organs，SLO)的形成有相似之处。TLS是由于感染、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、同种异体移植物识别和其他条件引发的持续性局部炎症，被称为TLS的组织在出生后在不可预测的位置形成，即TLS出现的部位并不确定，只有发生炎症才会刺激TLS在局部产生；而SLO则形成于胚胎发育过程中的特定的位置，与抗原或炎症无关，具有明确的细胞和分子间的作用机制[5,8]。已有多篇文献证明TLS与SLO结构类似，功能相近。

1.2TLS的形成过程 人类癌症周围的淋巴细胞或基质细胞局部产生CXC-趋化因子配体13(CXC- chemokine ligand 13,CXCL13)和细胞因子-7(IL-7)，CXCL-13和IL-7将淋巴组织诱导剂(lymphoid tissue inducer,LTi)募集到肿瘤组织部位[9]。T辅助细胞17 (T helper 17 cells，TH17)已被证明能够在各种病理情况下替代LTi细胞启动TLS形成。这些细胞与局部基质细胞相互作用，基质细胞表达趋化因子募集淋巴细胞，淋巴细胞表达肿瘤坏死因子及维持基质细胞分化的肿瘤坏死因子超家族第14个成员(the 14th member of tumor necrosis factor superfamily，TNFSF14)。LTi与基质细胞通过淋巴毒素-α1β2配体(lymphotoxin-α1β2，LTα1β2)与淋巴毒素β受体(lymphotoxin-β receptor，LTβR)结合，基质细胞分泌血管内皮生长因子C，从而促进高内皮微静脉(HEV)的发育[10]。HEV可以允许趋化因子、细胞因子等招募到的淋巴细胞进入炎症局部发挥作用。该信号通路还可促进黏附分子分泌，如血管细胞黏附分子1、细胞间黏附分子1或黏膜寻址细胞黏附分子1。LTβ-LTβR信号和IL-17的共同作用导致多种趋化因子产生，特别是CXCL12、CXCL13、CC-趋化因子配体19(CC-chemokine ligand 19，CCL19)和CCL21。这些趋化因子共同诱导淋巴细胞上LTα1(lymphotoxin-α1，LTα1)和LTβ2(Lymphotoxin-β2，LTβ2)表达，从附近的HEV招募淋巴细胞，并调控其进入T细胞和B细胞区[11]。其中CD3+T细胞区主要含有DC-溶酶体相关膜糖蛋白(DC-lysosome-associated membrane glycoprotein，DC-LAMP)和成纤维细胞网状细胞(fibroblastic reticular cells，FRC);CD20+的B细胞区具有生发中心、浆细胞、抗体与肿瘤抗原和FDCs形成的免疫复合物。此外，虽然没有证据表明TLS中存在有组织的淋巴传入系统，但小鼠动物实验证实，TLS中存在向引流淋巴结排放抗原和免疫细胞的传出淋巴管[12]。

1.3与TLS形成相关的趋化因子和细胞因子 与TLS形成相关的趋化因子和细胞因子有许多，诱导和刺激这些因子的产生可使TLS在肿瘤周围形成，导致更多的免疫细胞浸润，这种对TME的改变会转化为治疗的有效性和良好的预后。以下将对几个功能明确的趋化因子和细胞因子进行阐述。Silina等[6]通过免疫荧光的方法发现CXCL13是由TLS周围的血管内皮细胞、基质细胞及75%的肿瘤细胞分泌产生的，其可将LTi招募至肿瘤组织部位发挥作用。IL-7与CXCL13有相同的作用，IL-7的系统表达可在多个组织中触发TLS(甚至是额外的SLO)产生[9]。IL-17被证明也与TLS形成相关，可直接触发成纤维细胞表达CXCL13和CCL19，二者分别是形成B细胞滤泡和T细胞区所必需的趋化因子[13]；IL-17还可促进CXCL8、CXCL9和CXCL10表达，这些炎症趋化因子可有效地招募中性粒细胞。任何炎症刺激产生TLS几乎都通过LTi进一步发生发展，Rangel-Moreno等[14]发现阻断IL-17对已经产生的TLS几乎没有影响，但对淋巴毒素信号进行阻断会导致TLS溶解，说明IL-17对TLS的启动很重要，但对TLS的维持却没有影响。CCL21由TLS内的HEV分泌；CXCL12则由肺泡、稳定的支气管上皮细胞、肿瘤细胞及TLS附近的上皮细胞分泌产生。上述趋化因子在TLS从附近的HEV中招募淋巴细胞发挥重要作用。研究者对TLS组成和结构的探索仍在继续，与TLS相关的趋化因子、细胞、组织结构之间的“秘密”正在被破译。

2 TLS的识别及检测

与肿瘤微环境相关的细胞类型较多，结构复杂，不同类型的肿瘤具有不同的TME。如何从组织中识别检测和量化TLS是目前的热点问题，多篇文献对此已有探索。目前的识别方式主要有通过HE染色后显微镜下识别致密淋巴组织聚集物；通过免疫组化对TLS的免疫细胞选择性地显示和定量；通过定量病理学方法对TLS进行分析；通过免疫荧光分析TLS；以及用激光捕获纤维切割TLS选择基因表达谱。

对组织标本进行HE染色后，将致密的淋巴细胞组织聚集体定义为TLS，其密度计为每瘤周或每瘤内TLS数量/mm2。TLS主要是肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)的聚集体，TILs的评估主要基于国际免疫肿瘤生物标记物工作组的指南。由于TLS主要存在于肿瘤周围，因此对TLS的评估主要通过侵袭肿瘤边界内的TILs水平，TILs评估排除了肿瘤内的特定区域外，有坏死、压碎伪影、纤维化和先前活检部位的区域也被排除在外[15]。除显微镜下直接计数外，前沿(间质-肿瘤交界线)总周长的百分比也可用于肿瘤TLS数量的评估[16]。TLS由许多淋巴细胞组成，对TLS的识别、检测和定位也可通过对淋巴细胞标志物的染色来实现。双重免疫组化通过CD20染色滤泡B细胞、CD21染色滤泡辅助DC、DC-LAMP染色mDC(mature dendritic cells，mDC)、CD3染色T细胞区域、PD-1染色滤泡辅助T细胞，之后将组织切片数字化为全切片图像(whole-slide image，WSI)，用图像分析软件对这些WSI进行分析，通过对大量组织切片上的细胞计数，实现对TLS的高通量定量研究。最后也可以从不同的WSI研究不同细胞类型之间的空间关系，并进行图像配准步骤[17,18]。但对肿瘤组织中完全活跃的TLS的完整表征可能需要在同一组织切片上同时识别、定位和量化几个免疫细胞群和亚群。免疫荧光法更容易获得TLS的完整表征，在已报道的多篇文献中，对TLS的鉴别、定位以及结构的探索都使用了免疫荧光的方法[6,18-21]。如果进行多色免疫荧光方法，则需要用光谱分解软件处理所获取的多光谱数据。这种方法可以同时检测6个与核反染色相关的荧光生物标志物，但这种方法过程耗时，试剂和图像采集设备昂贵。定量病理学的方法对TLS进行识别和定位可分析不同成熟阶段的TLS，结合其他相关的TLS相关细胞类型，包括HEV和DC。为了区分不同的TLS成熟阶段，需要分析CD20、CD21和CD23表达的最小有功能的组合。配体外周结节寻址蛋白和DC-LAMP可用来评估TLS中血管系统的位置以及mDC的表达[22]。

以上TLS检测是深入研究TLS在不同解剖部位和病理背景下结构、组成和免疫功能的手段。然而，原位确定TLS的存在并破译其在局部微环境中的细胞和分子相互作用仍然是一个主要挑战，因为这些无包膜的结构会在炎症条件下自发地出现在非淋巴组织和/或邻近非淋巴组织内。为了全面了解TLS在体内与其环境之间的相互作用，需要特定的方法允许TLS在原位，即在其固有的组织微生态的背景下进行分子表征。激光捕获显微解剖(laser capture microdissection，LCM)为此提供了一种相对快速和准确的方法。它可在直接显微可视化下将感兴趣的组织区域从其自然组织微环境中分离出来并进行常规分析。目前已有一种通用的LCM方法成功应用于人肺肿瘤组织的TLS RNA图谱分析。实验顺序如下：冰冻组织制备；LCM分离；RNA提取；RNA完整性评估；反转录cDNA生成；定时定量PCR分析[19]。该方法可以为不同类型哺乳动物组织进行广泛的LCM和TLS分子分析提供基础。

3 TLS与肿瘤预后的关系

肿瘤的预后与其分期、分级、恶性程度等因素密切相关。随着人类癌症进入免疫治疗时代，人们对TME的探索逐渐深入，发现TME中免疫细胞浸润是肿瘤预后的有利因素，TME中淋巴细胞的浸润程度反映该患者的预后及疾病的转归。TLS是肿瘤等慢性炎症刺激部位淋巴细胞的聚集体，其密度等对肿瘤的预后具有预测作用。基于PD-1/PD-L1通路的免疫检查点抑制剂的免疫治疗也与TLS有关，Weinstein等[23]在小鼠肉瘤模型中发现，转染后的DC过表达T-bet及IL-36γ，将转染后的DC治疗性导入TME中可延缓肿瘤进展，促进TLS形成并抑制PD-1、CTLA-4和TIM-3表达。TLS对肿瘤预后有利，但肿瘤存在异质性，不同类型肿瘤的免疫细胞的浸润程度也存在差异。下文将以人类不同类型的肿瘤为例，综述TLS与肿瘤预后的关系。

3.1TLS与乳腺癌预后的关系 在乳腺癌中，Gu-Trantien等[24]在未经治疗的具有侵袭性的原发肿瘤中分离了浸润的CD4+T细胞进行了全面的分子图谱分析，发现浸润的T细胞亚群包括滤泡辅助T细胞(follicular helper T cell，Tfh)、Th1、Th2、Th17效应记忆细胞和Treg细胞(regulatory T cells，Tregs)等，T细胞信号通路改变的特征使细胞因子/趋化因子的产生受到限制。Tfh(CD200，CXCL13，ICOS)和Th1(CD38，CXCL9，CXCL10，CXCL11，T-bet)的8个基因的表达在广泛淋巴细胞浸润的肿瘤中具有明显倾斜，有力地预测了生存期或术前对化疗的反应，表明TLS在乳腺癌中是一个有利的预后因素。Liu等[25]回顾性分析了248例乳腺癌患者TLS与预后的关系，该研究表明，TLS与TIL的临床病理特征和生物标志物的关系相似，其存在与TIL水平无关，可能是HER2+乳腺癌患者重要的有利预后指标。Martinet等[26]在146例浸润性乳腺癌患者的回顾性队列中发现高密度的肿瘤HEV与T、B淋巴细胞浸润相关，且与较长时间的无转移、无病生存率和总生存率显著相关。另外一项针对乳腺癌患者的研究分析了原发和转移部位和4个转移部位(肺、肝、脑和卵巢)LTi的百分比及TLS的存在情况。该研究表明，原发灶和转移灶激素受体阳性、转移灶肿瘤浸润淋巴细胞水平高且TLS阳性的患者总体生存率明显提高[27]。对TLS与乳腺癌患者预后相关性的研究是在相对大的样本中进行的，多篇文献表明乳腺癌患者的预后与TLS显著相关。

3.2TLS与肺癌预后的关系 在肺癌中，Dieu-Nosjean等[28]采用免疫组织化学方法对74例早期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)石蜡包埋标本染色后进行回顾性研究，发现成熟DC的密度与良好的临床结果(总体、疾病特异性和无病生存期)高度相关。DC在肺癌中主要存在于肿瘤诱导的支气管相关淋巴组织中(tumor inducible bronchus associated lymphoid tissue， Ti-BALT)，提示Ti-BALT可能参与抗肿瘤免疫。在mDC浸润少的肿瘤中，肿瘤浸润的淋巴细胞密度明显降低，尤其是CD4+和T-bet+的Th1细胞密度明显降低，mDC密度与TLS存在的结合是更好的肺癌临床预后预测指标[28]。Germain等[29]的研究提示，无论是手术治疗的早期NSCLC患者还是接受化疗的晚期NSCLC患者，高密度的滤泡B细胞都与长期生存相关，滤泡B细胞和mDC密度相结合可确定具有最佳临床结果的患者。B细胞与DC一起被T细胞包裹形成成熟的TLS，表明TLS与患者的长期预后存在一定的相关性。在肺癌中只有存在生发中心的成熟TLS对患者预后有预测作用[6]。肺癌的预后与B细胞、mDC及T细胞密切相关，而这些细胞聚集成团组成TLS，提示了肺癌中TLS对塑造TME的免疫特征的重要性以及TLS对良好预后的预测作用[6,30]。

3.3TLS与大肠癌预后的关系 在大肠癌中，一项涉及351名Ⅱ期和Ⅲ期大肠癌患者的连续队列研究利用结直肠癌临床前模型评估了TLS在淋巴细胞募集中的作用。结果显示，人类结直肠癌和小鼠结直肠癌模型都存在组织化的TLS和HEV。在Ⅱ期结直肠癌患者中，TLS密度和TIL的浸润在预测较好的患者预后方面具有相关性和协调性[31]。TLS在识别低危险因素的早期结直肠癌患者时有协同抗肿瘤免疫功能，提示了一种新的结直肠癌预后生物标记物。此外，在对大肠癌预后预测因素的分析中发现，TLS分子谱的12个趋化因子(CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL18、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL13)的基因亚集与TLS显著相关，是独立于肿瘤分期、位置、微卫星不稳定或稳定性等导致患者存活率较长的因素而存在的。上述研究表明TLS密度高的结肠癌患者相较TLS密度低的患者预后更好[31-35]。

TLS在乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、胃癌、胰腺癌和头颈部鳞癌中均发挥预后预测的作用，TLS密度越高，浸润程度越高，成熟度越高，患者预后越好[36-43]。以上关于TLS的研究均为回顾性研究，笔者期待关于TLS的前瞻性研究的报道。

4 肿瘤的治疗对TLS的影响

目前肿瘤的治疗手段有手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等，无论哪种治疗手段，都会对TME造成一定的影响，包括杀伤肿瘤、释放更多抗原激活免疫或调节免疫细胞活性等。TLS作为TME的主要组成结构，也会随着肿瘤的治疗发生不同的变化，然而关于肿瘤治疗与TLS之间关系的报道较少。

Silina等[6]报道了TLS与化疗的关系，在肺癌中，化疗后TLS的密度不变，但存在GC的TLS明显减少。在该研究中，存在GC的TLS对预后具有预测作用，破坏GC后，这种预测作用随之消失。在TLS与放疗关系的研究中发现，放射治疗后TLS相关的肿瘤细胞凋亡增加。体内TLS对放疗高度敏感，在小鼠肿瘤模型中，TLS在接受放射治疗后面积减小，与TLS相关的细胞出现凋亡，但在放疗14 d后，TLS将再次出现，为优化TLS功能提供了机会[19]。

在肿瘤的免疫治疗时代，放疗可以杀伤肿瘤细胞，使肿瘤细胞以凋亡等方式释放更多抗原，从而为免疫细胞提供更多抗原，因此放疗联合免疫治疗一直是研究的热点之一。目前关于放疗联合免疫治疗的临床研究均显现出良好的疗效和安全性。2018 年美国国立综合癌症网络(national comprehensive cancer network，NCCN)指南根据 PACIFIC研究结果做出重要更新：推荐 Durvalumab 用于完成同步放化疗、一般状况良好的不可切除的Ⅲ期局部进展期NSCLC患者。同期放化疗后Durvalumab 显著延长患者无进展生存期(progression-free survial，PFS)，mPFS延长11.2个月；12个月和18个月的PFS率明显提高(55.9%∶35.3%；44.2%∶27.0%)[44]。放疗后对TLS的重塑提示TLS可能为免疫治疗联合放疗的新的治疗位点。TLS作为肿瘤TME的重要组成部分启动肿瘤免疫，目前尚无对免疫治疗前后TLS的形成及密度变化情况的相关报道。

5 总结与展望

TLS存在于慢性炎症周围，可为免疫细胞提供抗原提呈及应答的场所，与患者对治疗的反应及预后密切相关。通过人为给予各种细胞因子、趋化因子等方式在小鼠等临床模型中诱导TLS形成，对TLS组成及结构进行检测，在不同类型肿瘤患者及小鼠模型中验证了TLS与患者预后及患者对药物的反应相关。这些实验对于了解TME、破译肿瘤与机体免疫的关系具有重要意义。此外，诱导TLS的形成还可将冷肿瘤转换为热肿瘤，使部分对治疗不敏感的患者受益于不同的治疗手段。TLS作为机体抗肿瘤免疫应答的重要组成部分，与肿瘤免疫治疗有着千丝万缕的联系，探索免疫治疗与TLS的关系不仅能够精准选择对免疫治疗敏感的患者，还可以对TLS进行诱导，增加肿瘤组织部位淋巴细胞的浸润，解除免疫耗竭，使对免疫治疗不敏感的患者也受益于免疫治疗。TLS的存在是患者良好预后的指标，诱导TLS能否直接转换为肿瘤患者的临床收益还有待证实，笔者期待更多的关于TLS诱导及TLS与肿瘤免疫之间关系的探索。