抗菌肽LL37抵抗病原微生物感染研究进展

张 凯,王 杰,李梦莹,马小静,董 馨,孙鑫鹏,赵德明,周向梅,许立华

(1.宁夏大学农学院,宁夏银川750021 ；2. 中国农业大学动物医学院，国家动物传染性海绵状脑病实验室,北京海淀100193)

宿主防御肽又名抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)，最早是由瑞典科学家Boman H G于1980年在天蚕蛹中发现的一类阳离子小肽类物质，因其具有杀灭病原菌的作用，便被命名为抗菌肽[1]。抗菌肽广泛存在于动植物和少量微生物体内，是脊椎动物先天免疫的重要组成部分。作为一种分泌性蛋白，抗菌肽在机体抵抗病原微生物、新血管生成、创伤修复和杀灭肿瘤细胞等方面扮演重要角色[2]。哺乳动物的AMPs有2个主要类别：防御素家族和Cathelicidin家族。防御素家族的大部分成员在C末端包含6个保守的半胱氨酸残基，根据其半胱氨酸的间距模式分类为α、β或θ防御素[3]。Cathelicidin家族成员是在巨噬细胞和中性粒细胞的溶酶体和角质细胞中发现的多肽家族，其特征是保守的N端Cathelin结构域和高度可变的C端抗微生物结构域，通常为α螺旋或扩张性的结构。Cathelicidin家族成员存在于从鱼类到哺乳动物类的脊椎动物中，许多哺乳动物都含有Cathelicidin基因。

人源抗菌肽LL37是目前人体内发现的唯一一种Cathelicidin家族抗菌肽，于1995年被发现，由位于3号染色体上的CAMP基因编码，主要由巨噬细胞、单核细胞和各种上皮细胞的活性结构域释放[4]。LL37的前体是19.3 ku含信号肽的前原肽，C末端包含37个氨基酸残基，无活性。去掉信号肽后为18 ku(hCAP-18)，经细胞释放后，C端结构域在细胞外丝氨酸蛋白酶角质层胰蛋白酶(SCTE)和角质层胰凝乳蛋白酶(SCCE)的作用下产生有活性、分子质量为4.5 ku的 LL37，其包含有6个静正电荷，N末端疏水性很高,分子的中央部分残基形成典型的双亲性α螺旋结构，具有线性结构，无二硫键[5]。Cathelicidin的小鼠同系物CRAMP由CnlP基因编码，其与CAMP基因相似，因此两者具有相似的结构及功能[6]。

LL37是一种多功能蛋白，其具有广谱的抗微生物、抗毒素活性和机体免疫调节作用。

能够激活趋化性，连接先天免疫和获得性免疫，发挥免疫调节作用。本文着重就LL37的直接及间接杀菌作用以及外源物质促进LL37分泌帮助机体抵抗病原微生物感染等方面进行阐述，以期为后续开展的LL37在治疗和预防疾病等方面的研究工作提供新的思路和方法。

1 LL37对病原微生物的直接杀灭作用

LL37具有广谱的抗微生物活性，可以快速有效地抑制革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌及部分病毒，其通过带有阳离子并具有双亲性的表面螺旋结构与真核细菌、原核细菌或病毒DNA和RNA以及CpG-寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)和双链RNA(poly [I:C])通过静电相互作用形成具有免疫刺激性的复合物，并且 LL37能够直接穿过微生物细胞外层膜到达内层细胞膜，并引起细胞膜的破坏，导致病原微生物死亡。

1.1 LL37的抗细菌作用 LL37与细菌脂多糖(LPS)结合抑制了LPS与LPS结合蛋白(LBP)的相互作用，阻止LPS转移至其受体CD14，从而抑制其产生LPS性炎症反应及LPS性内毒素休克[7]。阮洋等[8]在用脂磷壁酸(LTA)诱导金黄色葡萄球菌感染的RAW264.7巨噬细胞模型中，发现TNF-α、IL-6及LL37表达量增加。外源加入LL37干预后，TNF-α、IL-6表达下降，由此可发现LTA可以引起巨噬细胞产生炎症反应，LL37减弱LTA引起的炎症反应。Stephan等[9]研究发现，由中性粒细胞胞外杀菌网络(NET)产生的LL37/DNA复合物通过P2RX7受体与网格蛋白介导的内吞作用进入人外周血单核巨噬细胞，之后在通过溶酶体对BCG产生杀菌作用。此外，LL37能够与表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等细菌带负电荷的生物膜相互作用，从而破坏细菌生物膜，降低了细菌的粘附性，以实现抗菌作用[10]。

1.2 LL37的抗真菌作用 从目前的研究发现，LL37能够抵抗假丝酵母菌、白念球菌感染。Chang等[11]研究发现，LL37和防御素hBD-3同参与真菌细胞壁β-葡聚糖代谢的细胞壁β-1,3-外切葡聚糖酶Xog1p相结合，降低了白念珠菌的粘附能力。由此可见，LL37对真菌的作用机理与细菌相似，均通过作用于病原体生物膜，来实现抑菌功能。

1.3 LL37的抗病毒作用 从目前的研究发现，LL37能够抵抗牛痘病毒、合胞体病毒、流感病毒、登革热2型病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒以及免疫缺陷病毒1型、鼻病毒、肝炎病毒等病毒的感染。Merkle M等[12]研究发现，LL37将可将胞外乙肝病毒DNA转入胞内，并减弱由乙肝病毒DNA引起的炎症反应。Lai Y等[13]发现在气道上皮细胞中，LL37通过双链RNA病毒增强TLR3信号通路，从而促进IL-1α、IL-6、IP-10、MCP-1等细胞因子的释放。此外，LL37可以直接在体外抑制腺病毒和鼻病毒复制。

由此可见，LL37抵抗病原微生物机制包括： (1)通过静电吸引与病原体膜结构相互作用并破坏其包膜而实现直接抵抗功能；(2)抑制病原体蛋白；(3)调节宿主抗病原体免疫应答。

2 LL37对病原微生物的间接杀灭作用

LL37不仅能够直接对病原菌起到杀灭作用，而且能够对细胞的生命活动产生影响，从而促进机体对于病原微生物的清除作用。从目前的研究发现，LL37能够调节细胞内多种信号通路并能够对细胞自噬和凋亡产生影响。LL37不仅参与天然免疫，而且其作为多功能固有免疫效应器，可募集并激活炎症细胞，包括树突状细胞和单核细胞。在单核细胞、肥大细胞和上皮细胞中，LL37通过表皮生长因子受体(EGFR)、甲酰肽受体样1(FPRL1)、TLR4和TLR9驱动生物反应，产生促炎性细胞因子和趋化因子，促进肥大细胞脱颗粒, 释放组胺，调节炎症级联反应[14]。

LL37对细胞的趋化作用通过G蛋白耦联受体MrgX2、细胞内 Ca2+浓度升高、磷脂酶C激活这一途径实现，G蛋白耦联受体阻断剂可阻断 LL37 对细胞的趋化作用。除此之外，LL37可使单核细胞胞膜甘露糖受体表达升高，进而使细胞抗原呈递和内吞作用增强。还能诱导树突状细胞分化，并且促进树突状细胞的内吞作用、吞噬受体的修饰、共刺激分子表达，增强Th1反应诱导细胞因子的分泌[15]。Rokeya等[16]研究发现，在结核分枝杆菌H37RV感染过程中，LL37通过激活P2RX7受体并激活胞内游离Ca2+途径、AMPK信号通路及PI3K信号通路诱导细胞自噬并杀灭H37RV。Hu等[17]揭示了LL37通过中和LPS的作用并抑制核苷酸受体P2X7对ATP的反应，在体外抑制LPS/ATP诱导的巨噬细胞的凋亡。Zhang等[18]研究发现，在皮肤损伤期间，LL37与MAVs信号通路促进表皮角质形成细胞分泌β干扰素。Pinegin等[19]研究发现，DNA与抗菌肽LL37的复合物还可通过诱导外周血单核细胞和树突状细胞释放I型干扰素来增强NK细胞功能。除此之外，LL37还可通过mTOR信号通路维持线粒体稳态，并影响NF-κB、Wnt/β-Catenin、PGE2-EP3 等多种信号通路。由此可见，LL37可以通过促进细胞凋亡与自噬、诱导细胞因子的分泌、调节炎症反应、并增强免疫细胞的功能来帮助机体清除病原微生物。

3 外源物质促进LL37的分泌抵抗病原微生物感染

作为一种抗病原体的功能性肽，细菌及其LPS是Cathelicidin家族类抗菌肽的强诱导源。但是，某些细菌如结核分枝杆菌等通过cAMP信号通路降低Cathelicidin表达[20]。此外，维生素D3、短链脂肪酸及其衍生物可以促进细胞分泌抗菌肽。

3.1 丁酸盐促进LL37的表达 丁酸盐是由膳食纤维在动物肠道菌群中的重要功能类群丁酸盐产生菌(Butyrate-producing bacteria，BPB)的作用下产生的，具有抗炎和免疫调节功能，对人体健康十分重要。在BPB缺失情况下，人类患有Ⅱ型糖尿病和肠炎的机率大大增加。结核病患者肠道内BPB菌群受到改变，使机体免疫力降低[21]。研究发现，丁酸盐不仅可以促进机体细胞分泌LL37，而且丁酸盐及其衍生物丁酸钠、丁酸苯酯、丙戊酸等短链脂肪酸的另一个身份是组蛋白脱乙酰化酶抑制剂(HDACi)，可以调控组蛋白去乙酰化，从而影响机体多种基因的转录。另外，丁酸盐能够通过调控G蛋白偶联受体以及NF-κB、Wnt/β-Catenin、JAK2/STAT、Notch1等信号通路，抑制促炎细胞因子的释放，促进抗炎细胞因子的释放从而抑制炎症反应，促进调节T细胞的增殖活化，维持机体免疫平衡[22]。除此之外，Han等[23]研究发现，丁酸钠可以上调MiR-203的表达，抑制结肠癌细胞的增殖。除此之外，HADCi族的其他成员，如TSA、芳酰基苯二胺类物质，亦能促进LL37的表达。

3.2 VD3促进LL37的表达 维生素D3(VD3)是人体生长发育中必不可少的元素，其与骨骼发育和钙的吸收息息相关。VD3需要在体内经历2次羟基化才变得具有生物活性。血液中的VD3在肝脏中羟化酶(CYP27A1)羟化成25(OH)D3，然后在局部组织1α-羟化酶(CYP27B1)羟化成活性的1,25-(OH)2D3形式。进而在循环系统中与VD结合蛋白(VDBP)结合，输送到各组织细胞，与VDBP分开并与VD3核受体(VDR)结合。该复合物与维甲酸X受体二聚体化，产生的异源二聚体为一个有效的转录调控因子，调控约900多个基因的表达，其中抗菌肽CAMP基因就包含在其中，该途径是VD3在免疫系统中发挥其活性的主要途径[24]。研究发现，TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-1β等能够上调免疫细胞中的CYP27B1和CYP24A1的表达，导致单核细胞中Cathelicidin表达增强。在细胞中IL-15介导的TLR2/1配体受到刺激后，编码VDR和CYP27B1的基因被上调，导致LL-37表达增强[25]。但是，在小鼠、大鼠和犬体内CRAMP基因的启动子中缺乏VDR受体，使得VD3不能诱导鼠及犬模型的Cathelicidin抗菌肽的表达[26]。

大量研究数据证实，使用丁酸盐及VD3等物质，能够帮助机体产生LL37从而抵抗病原微生物感染。外源物质促进抗菌肽的分泌为预防和治疗疾病提供了新的思路。

4 小结

对于抗菌肽的研究，为防止病原微生物感染以及某些自身免疫疾病提供了新的思路。从青霉素普及至今的70年间，抗生素的过度使用造成越来越多的细菌发展成为对传统抗生素产生耐药的菌株，甚至产生多耐药和超耐药菌株。耐药结核分枝杆菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)等的出现，使得人类对于病原菌的进化能力措手不及。传统抗生素通过抑制细菌细胞壁合成、干扰蛋白质的合成、阻断细菌核酸合成、影响细菌转录这4种方式杀灭病原微生物。然而，此类传统的抗生素作用机制，已经在长时期大剂量使用的持续刺激下，使某些细菌的基因发生进化，并且这些耐药基因可不断传播。耐药菌株通过产生抗生素相应的水解酶、改变菌体通透性、增加外排能力或者改变菌体内靶位结构等方式对抗生素产生抵抗。

为了能够解决这种日益严峻的问题，研究人员正努力寻找能够替代传统抗生素的新型抗菌药物。以LL37为主的抗菌肽便受到研究人员的重视。由于其抗菌活性高、细胞毒性低、抗菌谱广、种类多、可供选择的范围广、靶菌株不易产生抗性突变等原因，使其成为一种新型抗菌药物。至今，科研人员已经从昆虫、哺乳动物、鱼类及两栖动物，甚至是植物和少数细菌上都分离到抗菌肽并进行了深入的研究。不仅如此，抗菌肽及其衍生物已经在体外表达，并用于临床治疗。随着科研人员对于抗菌肽的继续研究，抗菌肽的功能将会被更进一步的挖掘出来，为人类预防及治疗疾病发挥更大的作用。