贝母属植物分子标记应用研究

张 田，倪典墨，郭忠静，杨诗雨，付玉宁，周嘉裕，廖 海

(西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031)

贝母属(Fritillaria)植物为多年生草本，隶属百合科(Liliaceae)。徐彦等报道国产贝母属植物有80余种，52变种，6变型，其中以四川、新疆与青海的野生种类最多[1]。贝母类药材以贝母属植物为来源，被划分为川贝母、浙贝母、伊贝母、湖北贝母与平贝母和安徽贝母等6种类型，其中仅安徽贝母尚未收载于2015版《中国药典》。川贝母主产于四川、西藏与青海等地区，药用价值最高，为贝母类药材上品，其基原植物包括川贝母(F.cirrhosaD.Don)、暗紫贝母(F.unibracteataHsiao et K. C. Hsia)、甘肃贝母(F.przewalskiiMaxim)、梭砂贝母(F.delavayiFranch.)、太白贝母(F.taipaiensisP. Y. Li)与瓦布贝母(F.wabuensisS. Y. Tang & S. C. Yueh)。浙贝母以浙江及其邻近省份栽培最多，产量居商品贝母的首位，其基原植物包括浙贝母(F.thunbergiiMiq.)及其变种东贝母(F.thunbergiivar. chekiangensis Hsiao & K. C. Hsia)。伊贝母主要产自新疆，其基原植物包括伊犁贝母(F.pallidifloraSchrenk)与新疆贝母(F.walujewiiRegel)。平贝母为平贝母(F.ussuriensisMaxim)的干燥鳞茎，主产于我国东北。湖北贝母(鄂贝母)为湖北贝母(F.hupehensisHsiao & K. C. Hsia)的干燥鳞茎，在长江中下游地区栽培较为广泛，产量仅次于浙贝。安徽贝母为皖贝母(F.anhuiensisS. C. Chen & S. F. Yin)的干燥鳞茎，为近年发展的中药贝母新品种。

由于贝母属植物具有重要的药用和经济价值[2]，已成为当地群众的重要收入来源，巨大的利益驱动导致某些贝母属野生物种遭受过度采挖，资源日趋枯竭，甚至在药材市场上出现以次充好的乱象[3]。研究贝母属植物的种质资源鉴定与遗传多样性不仅能够为野生资源保护提供思路，还能够确保贝母药材的安全性使用。其一，建立中药川贝种质资源鉴定体系，形成贝母属植物的“分子身份证”，能够从源头保障贝母药材的准确性，确保用药安全；种质资源鉴定不仅能合理有效地保存现有种质，而且能为开发新的贝母药材及其替代品提供思路。其二，研究贝母属植物的遗传多样性，了解种间及种内的遗传变异，掌握贝母属植物在特定环境下的繁殖与适应能力，有利于制定有效的保护与选育方针，提高贝母属植物的生存能力与产量。

目前，分子标记技术因数量丰富、遗传稳定、多态性高、多为共显性已成为植物种质资源鉴定与遗传多样性研究的重要支撑技术。本文结合课题组正在开展的研究工作，总结了不同分子标记用于贝母属植物种质鉴定与遗传多样性分析的情况，以期为资源保护、可持续发展提供理论基础及技术支持。

1 基于RAPD的贝母属植物遗传多样性分析及其种质资源鉴定

随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)技术以PCR为基础，采用10个左右长度的随机核苷酸引物，随机扩增基因组DNA。若DNA模板上与引物互补的反向重复序列存在多态性，即会产生多态性扩增图谱。

1.1 基于随机扩增多态性DNA的贝母属种质资源鉴定

李玉峰等[4]通过20条随机性多态引物，RAPD扩增得到127条电泳条带，其中103条为多态性条带，多态性比率为81.1%。多态性聚类结果表明，川贝母与康定贝母的亲缘关系最近，与瓦布贝母及浓蜜贝母的亲缘关系也较近，但与浙贝母、平贝母及伊贝母较远。由此，作者将贝母亲缘关系的远近归因于地理距离的远近。王成等[5]根据Xing等[6]筛选获得的RAPD标记，形成一套用于特异性鉴定川贝母的TaqMan实时荧光PCR方法，其检测样品中川贝母的最低含量可达0.05%，从而实现川贝母真伪品鉴定及相对定量。李敏等[7]对川贝母、浙贝母、湖北贝母进行RAPD分析，扩增得到39条谱带，多态性条带数在6-10条范围内，比较湖北贝母，川贝母与浙贝母的亲缘关系更近。

1.2 基于随机扩增多态性DNA的贝母属遗传多样性分析

王伟等[8]通过RAPD技术获得了青海省4个地区暗紫贝母的遗传多样性信息，并据此将不同地区的样品聚类在一起，表明RAPD技术具有种下的鉴定能力。李庆等[9]筛选出14条随机引物，扩增出121条多态性电泳条带，长度集中在250～1000 bp之间，多态性达到100%。聚类分析表明，川贝母复合群不同种之间、相同种在不同分布区、野生和人工栽培之间的遗传多样性受到了不同生态环境的显著影响。更为重要的发现是瓦布贝母野生型与栽培型遗传性最为相似，显示其作为栽培种的优势。

2 基于ISSR的贝母属植物遗传多样性分析及其种质资源鉴定

简单重复区间序列(Inter-simple sequence repeats，ISSR)在分子水平上是一类由1～5个核苷酸为一个重复单位而组成的一长串核苷酸重复序列，通常长度较短，多见于真核生物基因组中。ISSR分子标记技术是一种在SSR基础上利用锚定的微卫星DNA为SSR引物，来对基因组(特别是重复序列)进行扩增的标记系统。

2.1 基于ISSR标记的贝母属种质资源鉴定

黎开强等[10]对主要采集于四川省甘孜州与阿坝州的10个贝母种及1个浓蜜贝母变种进行分析，利用11条引物，扩增出179条条带，其相对分子质量介于200～2000 bp，多态性比率为86.18%。比较各种贝母物种间的遗传相似系数，湖北贝母与其它贝母物种亲缘关系最远，并且来源于同一地区的贝母物种常常聚在一起，推测原因可能是不同贝母物种间存在异花授粉，该类型基因交流弱化于不同物种间的遗传差异，导致后代遗传相似性增加。

2.2 基于ISSR标记的贝母属遗传多样性研究

张婕等[11]对川贝母鳞茎及叶片进行高通量测序，采用MISA对Unigene进行SSR位点分析，共检测到3817个SSR位点，分布于3367条序列中，SSR出现频率为8.49%，6种SSR重复类型的重复次数主要集中于4～12次。由此他们发现川贝母的SSR位点出现频率较高而且类型丰富，多态性很高，便于后续遗传多样性分析和遗传图谱的构建。詹羽姣等[12]对伊贝母的16个野生和栽培居群，共128份样品进行遗传多样性分析，利用15条引物，扩增出239条条带，多态性比率为94.98%，有效等位基因数(Ne)为1.3426，Nei的基因多样性(H)为0.2190，Shannon指数(I)为0.3503，得出伊贝母居群间有较高的遗传多样性，并提示地理位置的远近对遗传差异有较大影响。刘晓贤等[13]对8个浙贝母居群、1个东贝母居群、1个皖贝母居群和2个川贝母居群进行ISSR聚类分析，发现磐安浙贝居群已明显区别于其他产区浙贝居群，并且长期的留种栽培使磐安浙贝遗传多样性水平降低，形成相对稳定的遗传。王果平等[14]对新疆贝母属遗传多样性进行了ISSR聚类分析，将十种贝母分为三个类群，其中大白花贝母、小白花贝母、黄花贝母和托里贝母聚类在了一起。

3 基于SNP标记的贝母属植物种质资源鉴定

单核苷酸多态性(Single nucleotide plymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由于单个核苷酸变异而导致核酸序列多态，即基因中的点突变，包括置换、颠换、缺失和插入。

3.1 基于SNP标记的贝母属种质资源鉴定

徐传林等[15]对贝母属ITS区的DNA测序发现，药用川贝母类的ITS区第75位碱基为“C”，即该位点上下游含有SmaI酶切位点(该酶的识别序列为CCCGGG，下划线为第75位碱基)，而非川贝母类为“T”(该处序列为CTCGGG，下划线为第75位碱基)，没有该酶切位点，可作为鉴定川贝母的独征性位点。由此，建立了聚合酶链反应-限制性酶切图谱(PCR-RFLP)方法，并已收载于《中国药典》2010年增补版，该方法在PCR技术的基础上，利用SmaI限制性内切酶对川贝母ITS的PCR产物进行切割，川贝母在100～250 bp间出现两条条带，非川贝母没有对应电泳条带。孙丽媛等[16]依据该原理，研制了DNA检测试剂盒，对全国的药材市场的70份川贝母样品进行了真伪调研，结果正品有37份，伪品率高达47.1%，这为川贝市场的管理提供了基础数据。采用该方法对川贝母、浓蜜贝母、中华贝母、康定贝母、长腺贝母、平贝母、浙贝母及伊犁贝母等不同贝母属植物进行了鉴定，发现该方法仅能区分平贝母、浙贝母及伊犁贝母，而浓蜜贝母、中华贝母、康定贝母、长腺贝母与川贝母均出现了相同的酶切图谱，表明该方法的鉴定准确度有待提高[17]。

兰青阔等[18]对贝母属6种植物15条叶绿体基因组序列进行分析。结果发现，不同贝母的叶绿体基因组DNA同源性较高(98.38%)，共发现SNP位点5879个，其中供川贝母类鉴别候选位点71个，供瓦布贝母、太白贝母、浙贝母、湖北贝母与平贝母鉴别的候选位点分别为25个、120个、61个、79个和794个。

4 基于AFLP标记的贝母属植物遗传多样性分析

扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)技术是基于PCR的选择性扩增限制性片段的方法。基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生不同分子量的限制性片段，接着以特定的双链接头与限制性片段连接作为模板，用选择性引物扩增出多态性产物。

4.1 基于AFLP标记的贝母属遗传多样性研究

徐金中等[19]对6个浙贝母居群共32份个体进行AFLP分析，发现浙贝母物种的遗传多样性水平丰富，并且居群间的多样性水平明显低于居群内的多样性水平，居群间遗传分化不明显，表明浙贝母适应环境能力较强，种植资源相对比较稳定，这些居群适宜作为浙贝母优良品种的选育基地。

5 基于DNA条形码的贝母属植物遗传多样性分析及其种质资源鉴定

DNA条形码技术是一种建立在PCR技术及DNA测序技术基础之上的，利用基因组中一段标准短序列来快速保守地进行物种鉴定。植物类DNA条形码有来自核基因组的ITS1与ITS2，叶绿体的psbA-trnH，rbcL与ndhJ，以及线粒体基因组的matK序列等。陈士林等[20]首次提出ITS2为主、psbA-trnH为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系。利用ITS2序列对含有(及不含有)小檗碱的植物建立分类体系，获得了含有小檗碱的植物的特征性DNA标鉴，有望用于黄连、黄柏等川产道地中药的鉴定。

5.1 基于DNA条形码的贝母属种质资源鉴定

苏鹏等[21]采用PCR扩增技术获得8个贝母品种的psbA基因序列，结果显示8个贝母品种psbA序列长度在340～355 bp，G+C平均含量为34.7%，序列中1～9 bp与140～154 bp区域中存在碱基变异位点，其中暗紫贝母在141～154 bp处含有特征序列ACCATTTTTTTTTA，有望用于暗紫贝母的分子鉴定。且在鉴定川贝母时采用psbA序列分析的方法要优于ISSR分析，该方法较之于ISSR分析更为简便，成本低，具有更大的实用价值。汪波等[22]针对川贝母及非川贝母ITS1序列设计了10条特异探针，最低检测限度可达到掺伪10%，表明该方法可有效检出川贝母药材掺伪，并可反映市场药材掺伪比例。2012年，罗焜等[3]运用DNA条形码鉴定技术对川贝母药材5种不同基原植物物种和其余13个样本、10个物种进行了试验分析，结果发现ITS2的一级与二级结构能很好的区分川贝母及其混伪品。2014年，俞超等[23]扩增了8个贝母属21个样品的ITS1与ITS2序列，并比较了各样品DNA提取率、PCR扩增率及测序成功率，发现ITS1序列鉴定成功率为72.2%，而ITS2为100%，表明ITS2序列能够更准确鉴定不同贝母。高梓童等[24]基于ITS2序列对川贝母中成药的鉴定，建立了包含贝母属208条ITS2序列的数据库，收集了市售20份川贝中成药扩增其ITS2序列，对PCR产物进行克隆测序，对测序结果进行BLAST比对，选取3份蛇胆川贝胶囊进行高通量测序，并利用单克隆和二代测序相结合的混合测序方法对该3份中成药中川贝母再次鉴定，数据表明混合测序的3份蛇胆川贝胶囊中均不含川贝母，所以基于单克隆和二代测序辅助的方法可以准确对川贝母中成药进行鉴定，但DNA条形码鉴定仍存在局限。研究发现，依据ITS2序列构建的进化树能够将不同贝母属植物分为“北方贝母群”(包括平贝母与伊犁贝母)与“南方贝母群”(包括浙贝母、浓蜜贝母、中华贝母、康定贝母、长腺贝母和川贝母)，后者又可细分为浙贝母与“川贝母复合群”，其中“川贝母复合群”中的贝母品种具有相近的亲缘关系。这说明ITS2条形码序列不仅能够对川贝母及其部分近缘种进行快速、准确地鉴定，还能够清晰不同贝母种之间的亲缘关系[17]。

5.2 基于DNA条形码的贝母属遗传多样性研究

ITS2序列不仅能够用于不同贝母属植物物种的鉴定，还能够反映不同居群间的遗传多样性。例如，来自青海西宁(暗紫贝母1、2号样品)与四川阿坝(暗紫贝母4、5号样品)的暗紫贝母形成了2个居群，它们存在较大的遗传变异，在进化树中距离较远。并且，来自相同地区的暗紫贝母与梭砂贝母亦存在居群内部的遗传变异，例如，来自青海西宁的3个暗紫贝母(暗紫贝母1、2、3号样品)与2个梭砂贝母(梭砂贝母1、2号样品)在进化树中并未聚在一起。我们的试验结果也发现来自青海西宁与四川阿坝的暗紫贝母形成了2个不同居群，存在较大的遗传变异[17]。

6 讨论与展望

第一，从贝母属植物种质资源鉴定与遗传多样性分析所利用的分子标记来说，目前主要集中于RAPD、SNP、AFLP、ISSR和DNA条形码等5种分子标记，而其他分子标记在贝母属遗传学和种质鉴定方面的运用甚少。究其原因，这可能与相关研究人员的选择倾向有关，一般大家都会选择最有效、最占优势的方法来进行研究工作，如RAPD、SNP与DNA条形码等标记技术，相对于其它分子标记技术的使用频率更高。

尽管不同分子标记技术基于不同的试验原理，但是取得的试验结果归根结底应追溯到不同贝母属植物之间的DNA差异，因此综合比较不同分子标记的数据，能够得到更准确的分析结果。例如，比较川贝母与非川贝母的亲缘关系时，RAPD、ISSR与DNA条形码均显示川贝母与浙贝母、平贝母、伊贝母及湖北贝母亲缘关系由近到远，其中川贝母与浙贝母同属南方贝母群，后几种贝母属于北方贝母群[23]。SNP结果显示川贝母复合群中，太白贝母的SNP变异最高，可能与其它贝母亲缘关系最远[18]。我们最近的试验亦支持太白贝母可能是川贝母复合群中最早分化的类型，这一结果与SNP结果吻合[17]。然而，不同分子标记技术均有各自优缺点。甚至相同技术也可能得到差异的结果，比如王果平等[14]的ISSR结果发现新疆贝母、伊贝和裕民贝母分为一类，额敏贝母为单独一类。而詹羽姣等[12]采用ISSR分析发现新疆贝母与伊犁贝母分为一类，额敏贝母与裕民贝母为另一类。因此，无论用哪种分子标记来研究贝母属植物，只要这种分子标记有效，我们都应该大量尝试，并反复使用，从而得到最终的准确结果。

第二，研究贝母属植物不同居群的遗传多样性能够在一定程度上反映了资源现存的某种状态，从ISSR与AFLP的分析结果来看，伊贝母、浙贝母物种的遗传多样性较丰富，表明两种贝母资源较丰富、破坏较小[12]。遗传多样性或遗传差异与地理位置的差异有着高度相关性，来自相同地区的异种样本遗传差异会减小，推测是由于异种样本间产生了基因交流导致；而不同地区的同种样本遗传差异会增加，这可能是由于同种植物在不同地区产生了进化差异。李玉锋等[4]，黎开强等[10]与李庆等[9]均有类似结果的研究报道。

第三，在对不同方法的比较中，DNA条形码由于序列较短，降低了提取、扩增和测序的难度，有利于获取发生降解的样本序列片段，是现阶段内较适合作为药用植物大批量、快速鉴定的技术。适用于贝母鳞茎干片、粉末等市场流通样品的鉴定，鉴定川贝母正品与混伪品效果较为理想[21]。其中，ITS2条形码来源与核基因组，与psbA-trnH、matK等叶绿体条形码比较，属于中度保守区域，其保守性表现为种间差异较为明显，因此用于鉴定川贝母正品与混伪品效果较为理想。然而ITS2序列在区分川贝母不同基原植物时难度较大，区分效果不明显，需要与其它条形码序列配合使用。

第四，依托植物基因组信息开发分子标记具有准确性高，重现性好的明显优势，也已在水稻、玉米等农作物中取得了喜人的研究成果。然而，由于贝母属植物基因组中含有大量的高度异质性、相对低丰度的重复序列，形成巨大基因组[26]，以现有的测序技术无法完成基因组测序，利用较低成本的功能基因组学(比如转录组)获得其RNA信息，进而筛选合适的分子标记是一条可行的替代方法，现已迫在眉睫。

第五，针对分子标记技术的定量研究方面，目前仅王成等[5]利用TaqMan实时荧光PCR方法能够用于样品中川贝母的相对定量，但成本较高。

第六，分子鉴定技术与其它鉴定技术的结合，由于目前尚未有贝母属植物成熟的分子鉴定标准，因此建立以分子鉴定为主、形态鉴定和(或)化学鉴定为辅的鉴定体系，使得鉴定结果更加可靠[9]。

综上所述，分子标记技术的应用极大地促进了贝母属植物遗传学的发展，进一步加强分子技术的运用，加快贝母属植物种质资源鉴定与遗传多样性研究等方面的研究进展，是保护好贝母资源的有效保障。