伪狂犬病病毒感染后引起信号转导通路变化的研究进展

张 森，汤德元，曾智勇，黄 涛，王 彬，郭倩妤，廖少山

（贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是伪狂犬病（PR）的病原，属于疱疹病毒科（Herpesviridae）、α-疱疹病毒亚科、水痘-带状病毒属，是一种线状双股DNA 病毒[1]。该病毒可以感染多种哺乳动物，人对PRV 不易感，但近期报道有人疑似感染PRV 的病例出现[2]。猪是PRV 的储存宿主，同时也是伪狂犬病的重要传染源，成年猪感染后一般不表现明显的临床症状，但PRV 会潜伏感染于猪的神经系统中，三叉神经节以及骶神经节是其潜伏感染的主要部位。

信号通路转导是一个复杂的过程，其与细胞自噬、细胞凋亡、抗药性、潜伏感染和癌症等因素密切相关，且有研究表明病毒感染机体后会引起信号通路转导发生变化而产生一系列反应[3]。截至目前，已研究发现PRV 感染后发生反应的信号通路主要 有PI3-K/Akt 通 路、NF-κB 通 路、p38 MAPK 通路、JNK/SAPK 通路、ATG 通路和IFN 通路等。本文主要对PRV 感染后引起的上述信号通路变化逐一阐述，分析由PRV 引起信号转导通路而产生的一系列反应，为进一步探究PRV 信号转导通路提供参考。

1 PRV 感染后对PI3K/ Akt 信号通路的影响

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3-K/Akt）是抗细胞凋亡的主要途径，由PI3K 及其下游因子Ser/Thr 蛋白激酶两部分组成，PI3K/Akt 存在于大多数真核细胞中，是机体最重要的信号转导通路之一，该信号通路可在病毒感染细胞后被激活并产生作用[4]。其中Akt 是一种有效抑制细胞凋亡的分子，活化的Akt可以使caspase-9、BAD 等促凋亡相关因子磷酸化而失活[5-6]。因此，病毒可通过激活PI3K/Akt 通路抑制细胞凋亡从而在存活的细胞中大量增殖。

Us3 基因是PRV 重要的毒力基因，该基因在α疱疹病毒家族中十分保守，是疱疹病毒家族中重要的抗细胞凋亡基因之一，其不仅与核衣壳的包裹有关，且可编码Us3 蛋白激酶（Us3PK）[7]。有研究表明，PRV Us3PK 具有抗细胞凋亡、增强PRV 的传播作用等特定功能，还可以参与PRV 和宿主细胞之间的各种相互作用[8]。Geenen 等将PRV 野毒株及PRV Us3 缺失株同时感染猪睾丸细胞并检测其细胞凋亡，结果显示PRV 野毒株细胞凋亡指标明显低于缺失株，表明Us3PK 可以使PRV 感染的细胞免于凋亡[9]。Chang 等研究显示，PRV 感染宿主细胞的早期，会诱导PI3K/Akt 通路发生反应，使抗凋亡相关因子表达量提高，从而抑制PRV 感染后的宿主细胞凋亡，这个结果也在动物体内得以验证；同时将Us3 转染至细胞内发现，Us3 在细胞内表达后可诱导Akt 及其上游信号分子PDK-1 的磷酸化[10]。上述研究在与PRV同为α疱疹病毒家族且同样具有Us3PK 的单纯疱疹病毒1 型中也得到了验证[11]。以上研究表明Us3 对PRV 诱导PI3-K/Akt 信号通路抗细胞凋亡以促进PRV的复制有直接联系。

自噬是细胞在溶酶体中降解自身物质的一种细胞内机制，是细胞维持内环境稳态及抵抗病原微生物感染的保护措施，同时在先天和适应性免疫中发挥重要作用，细胞自噬与病毒感染的关系存在两重性，许多病毒已经进化出了逃逸自噬的机制，有的甚至能够利用自噬以促进自身的感染[12]。PRV 是一种大型复杂的病毒，可在宿主体内建立终身持续性感染[13]。Sun 等证明了PRV Us3PK 的新功能，其通过激活PI3-K/Akt 途径来抑制细胞自噬，以达到长时间在宿主细胞内增殖的目的，表明PRV 可能存在一种通过拮抗宿主自噬以促进其复制的方法[14]。综上所述，PRV 感染后其表达的Us3PK 会诱导细胞PI3K/Akt信号通路阻止细胞的凋亡及自噬，从而使病毒在受感染细胞中大量增殖，对其进行深入研究将为揭示PRV 如何在细胞中或机体内潜伏感染提供参考。

2 PRV感染后对NF-κB信号通路的影响

核因子kB（NF-κB）家族是一类转录调节因子，在免疫应答和炎症的调节中起着关键的作用，其几乎存在于所有哺乳动物细胞中[15]。NF-κB家族一共包括5 种蛋白，分别为NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2（p52/p100）、RelA（p65）、c-Rel 和RelB。一般情况下，NF-κB 在细胞中与其抑制蛋白IκB 结合形成p50/p65/IκB三聚体复合物并处于失活状态，当细胞受到如病毒、炎症因子、紫外线等外界因素刺激时，IκB 被磷酸化并从三聚体中解离，或经泛素化修饰后被降解，NF-κB信号通路由此活化并启动相应转录程序[16]。

PRV 的早期蛋白Eb0 具有泛素连接酶（Ubl）活性，通过操控泛素通路水解免疫蛋白的方式介导NF-κB 等信号分子的分解，从而抑制干扰素通路的激活，由此降低机体抵抗PRV 的能力[17]。Fan 等研究表明，PRV 在感染细胞的早期阶段会激活NF-κB信号通路，虽然在感染的全过程中NF-κB 亚基（p50、p65 和c-Rel）和IκBα的总表达水平无变化，但在感染早期阶段（50 min～120 min）的IκBα磷酸化水平增加，所有NF-κB 相关蛋白在感染后30 min～240 min 内磷酸化均受到抑制，表明PRV 在感染的早期阶段会显著诱导NF-κB 信号通路从而增强细胞的应激反应；同时增加Us3 表达会促进NF-κB 抑制蛋白I-κBα的磷酸化，表明US3 可能存在不同的机制协助PRV 对细胞的感染，这一点还需要未来进一步研究[18]。Romero 等研究显示，PRV 感染细胞后会激活NF-κB 信号通路，NF-κB 活化后可在细胞内表达IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子，这些炎症因子可帮助细胞对抗PRV 的感染，所以该通路的激活有助于上调受PRV 感染细胞的早期炎症反应，提高细胞对PRV 感染的免疫应答，但PRV 感染后在细胞中的增殖可能与NF-κB 信号通路无关[19]。Lee 等通过化学抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）实现了对NF-κB 信号传导途径的抑制，结果表明阻断NF-κB 信号通路并没有影响PRV 诱导的细胞病变（CPE）和细胞凋亡[20]。Yeh 等将PRV 感染使用显性阴性IκBα或显性阴性IκBβ处理的细胞后以探究PRV诱导NF-κB 信号通路与细胞凋亡的关系，结果与上述一致，同样认为PRV 感染后诱导的NF-κB 信号通路与细胞凋亡无关[21]。由此可见NF-κB 通路可能也对PRV 引起的细胞凋亡无影响。

NF-κB 活化因子结合激酶（TANK1）在产生1 型干扰素（IFN-I）的抗病毒天然免疫中发挥重要作用。刘晓贺等将PK-15 细胞的TANK1 基因敲除，利用PRV 感染该细胞系后发现，IFN-β、ISG 15 及IL-1β的表达均被抑制，同时病毒基因转录、蛋白表达以及子代病毒的感染力均有所提高，从侧面表明NF-κB 通路在机体参与抗PRV 感染的天然免疫反应中的重要性[22]。Liu 等研究显示木犀草素可以有效抑制由PRV 感染细胞后由NF-κB 诱导的NO、iNOS、COX-2 等体外促炎细胞因子的表达，表明木犀草素可能对抗PRV 感染有一定作用，对PRV 未来通过NF-κB方向治疗的研究提供了参考[23]。

3 PRV 感染后对p38 MAPK 信号通路的影响

促分裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）信号通路可以促使细胞释放出多种外部信号，并使受体细胞作出适当的反应，p38 MAPK 通路对应激反应、炎症反应以及细胞的增殖和分化均具有重要意义[24]。p38MAPK 的活化与其他蛋白激酶类似，需要通过磷酸化来诱导自身构象重组，促使其与底物的结合。有研究表明病毒感染细胞后可以通过p38MAPK途径产生生理作用[25]。一般情况下，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的产生在一定程度上反映了p38 MAPK 通路的活化，当抑制p38 MAPK 通路会显著影响TNF-α的表达[26]。Lin 等发现PRV 感染后可以增加细胞内TNF-α 转录、翻译和分泌以及TNF-α受体表达，即PRV 感染细胞后可能会诱导p38 MAPK 通路活化[27]。Yeh 等利用MAPK抑制剂阻断细胞内MAPK 的信号传导，然后用PRV 分别感染阻断MAPK 通路细胞的实验组及未阻断MAPK通路细胞的对照组并测定各组存活细胞及凋亡细胞，结果表明被病毒感染后的实验组仅有15%的细胞出现典型的CPE，远远低于对照组，且细胞凋亡数与对照组相比也减少，由此推测p38 MAPK 通路可能抑制了PRV在机体的潜伏感染[21]。

4 PRV 感染后对JNK/SAPK 信号通路的影响

JNK（c-Jun N 末端激酶）又被称为应激活化蛋白激酶（SAPK），是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成员之一，介导真核细胞通过活化蛋白激酶途径以减少对非生物和生物应激损伤的反应，是真核生物进化过程中一种相对保守的信号通路[28]。JNK/SAPK 通路可以被许多炎症因子激活从而参与炎症反应和调控细胞增殖、分化、自噬、凋亡等过程[29]。TNF-α与白细胞介素（IL）是影响该通路的重要炎症因 子，有 研 究 表 明IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12 和TNF-α可介导细胞的炎症反应，随之可诱导JNK/SAPK 信号通路，从而引起细胞内质网的应激反应[30]。Yeh 等研究显示，PRV 感染细胞后会显著诱导TNF-α的分泌，而对IL 等炎症因子的分泌影响不大，并且感染的细胞中随着感染时间的延长分泌的TNF-α会随之增多；同时将PRV 感染阻断JNK/SAPK通路后的细胞，细胞内TNF-α的表达和分泌被阻断，同时发现抗TNF-α抗体会降低PRV 诱导的细胞死亡，表明TNF-α抗体可能具有治疗PRV感染的潜力[23]。

5 PRV 感染后对ATG 信号通路的影响

自噬相关蛋白（ATG）是促进细胞自噬的重要物质，长期以来人们认为ATG 是细胞自噬所必需的，同时该类蛋白形成了一种复杂的信号通路网络[31]。其中Beclin 1、ATG7 和ATG5 是3 种调节细胞自噬的重要蛋白。其中Beclin 1 是首个被发现的哺乳动物的自噬基因，它是酵母自噬基因Atg6 的同源基因，是自噬机制的核心成分，通过激活Vps34 在自噬调节中发挥核心作用[32]。胡林将PRV 感染PK-15 细胞，利用RT-qPCR 及western blot 检测结果显示，Be⁃clin 1 的mRNA 及蛋白水平均显著增加，相关蛋白水平也呈现明显上升趋势，表明PRV 感染后细胞表达的Beclin 1 可促进细胞的自噬[33]。Xu 等为了进一步研究自噬在PRV 复制中的作用，利用特异性靶向Be⁃clin1、Atg7 和Atg5 的siRNA 片段干扰N2a 细胞，以沉默内源性的Beclin-1、ATG7 和ATG5 自噬蛋白，然后将PRV 同时感染该N2a 细胞与正常N2a 细胞，结果显示经过干扰的N2a 细胞与正常N2a 细胞相比病毒滴度显著降低，将这3 种蛋白敲除后可以抑制病毒释放。表明PRV 感染N2a 细胞后可通过经典的Beclin 1-ATG7-ATG5 自噬途径特异性地诱导细胞自噬以增强PRV 复制[34]。这个结论与前文Sun 等人的研究结果相反，推测可能是感染病毒的毒力不同导致，也有可能是PRV感染后通过不同信号通路对机体产生的影响不同，再就是PRV感染神经细胞的机制可能与感染其他细胞的机制不同，其中的机制需要进一步探究。

6 PRV感染后对IFN信号通路的影响

早期研究显示，IFN 对PRV 感染的早期基因表达起到负调控作用，即IFN 对PRV 在机体内的复制有抑制作用，有关PRV 感染细胞后影响IFN 信号通路的研究目前正在迅速增多[35]。Kathlyn 等的研究显示，IFN-I 在调节小鼠PRV 感染的早期神经炎症反应和临床症状中起关键调控作用，强毒力的PRV 会有效抑制IFN-I 的表达从而使病毒在细胞中复制和传播，弱毒株能激活IFN 信号通路引起快速的IFN-I反应以抑制病毒复制从而降低PRV 对细胞的损伤，该研究为PRV 感染后诱导IFN 信号通路发生反应并调控机体免疫的原理提供有力支撑[36]。

Wei 等研究表明，将PRV 分别感染IFN 受体缺陷性小鼠及野生型小鼠，结果显示IFN 受体缺陷性小鼠的存活率显著降低，同时IFN-α及IFN-β表达量较野生型小鼠明显减少，IFN 受体缺陷性小鼠与正常小鼠相比伪狂犬病症状更为明显，且引起的神经症状早24 h 出现，所以缺乏IFN 就失去了机体抵抗PRV 感染的一层屏障，表明IFN 的产生对机体抵抗PRV 感染起到重要作用[37]。干扰素刺激基因15（ISG15）是由IFN 诱导的泛素蛋白，在IFN 相关信号通路中起到重要作用。Liu 等发现ISG15 过表达可以抑制PRV 在PK-15 细胞中的复制，增强了IFN的信号转导，提高了IFN-β的mRNA 转录水平及蛋白质的表达，表明ISG15 可以通过诱导细胞内IFN 信号通路的活化从而在抗PRV 感染后发生的免疫反应中起到了重要的作用，为未来PRV 的治疗提供参考[38]。

Xie 等对猪干扰素刺激因子（poSTING）进行了分子克隆及功能鉴定，并将该基因在几种猪细胞系中表达，结果显示poSTING 可激活IFN-β启动子，从而诱导IFN-β的表达，表明poSTING 是猪先天免疫信号的重要调控因子，可能在抗dsDNA 病毒中发挥作用[39]。近期，侯璐等采用CRISPR/Cas9 基因编辑技术将猪肺泡巨噬细胞系（3D4/21）中Sting 敲除，PRV感染该细胞系后，与未敲除Sting 的细胞相比，病毒基因的转录、蛋白的表达、子代病毒的感染力均有所提高，且IL-1β、IFN-β、ISG15 的转录水平下降，表明STING 在抗PRV 感染中起到重要作用[40]。如果将Sting 在细胞内过表达，是否可以提高细胞对PRV 的抗感染能力及弄清其引起的免疫逃避机制，还有待于进一步研究。

7 小结与展望

综上所述，当PRV 感染猪或动物细胞时PI3-K/Akt 通路、NF-κB 通路、p38 MAPK 通路、JNK/SAPK通路、ATG 通路和IFN 通路均可发生作用并对细胞调控产生一定影响，研究这些通路的发展过程可以更加透彻的了解PRV 的致病机理并可为PRV 感染疾病的治疗及预防提供一些新的思路。PRV 的潜伏感染是控制并消灭该病的难点所在，可以通过诱导某种信号通路或者通路中的关键分子，从而可能实现对PR 的靶向的治疗及预防。

三叉神经节（TG）是PRV 潜伏感染的关键区域，本实验室目前致力于研究PRV 感染TG 后NF-κB 及PI3K/Akt 信号通路在其中的作用并取得一定进展。本研究室将PRV 感染小鼠原代TG 细胞后，通过检测某些指标显示，TG 细胞出现CPE 且PRV 在TG 细胞核内吸附并增殖；ELISA 结果显示，PRV 感染TG的36 h～60 h 时IL-1 的表达量达到峰值，而IL-6 的表达量则在PRV 感染早期即达到峰值，表明PRV 感染TG 后可能会诱导NF-κB 信号通路活化，从而提高了IL-1、IL-6 等炎症因子的表达水平，增强了TG细胞的免疫应答。未来可以考虑提高TG 中NF-κB信号通路及其上游炎症因子的表达以增强宿主免疫应答反应，从而阻止PRV 在TG 中的潜伏感染。髓样分化因子88（MyD88）和IFN-β TIR 结构域衔接蛋白（TRIF）是NF-κB 信号通路的两个上游因子，本研究室研究结果表明MyD88 和TRIF 均对PRV 感染TG后的炎症因子的产生及诱导NF-κB 信号通路活化发挥着正调控作用，且二者是相互协同的关系。（数据未发表）

信号通路转导机制错综复杂，不同通路之间相互联系、互相影响，当前对PRV 信号通路的研究较少，对不同信号通路之间的相互作用及其导致细胞因子、受体的变化也研究不足。因此，不仅需要对PRV 感染后诱导其他信号通路所产生的影响进行研究，更要剖析其中关联，这将有助于揭示PRV 的致病机制及开发预防和治疗PR 的新方法提供参考。