犬尿氨酸酶在乳腺浸润性导管癌中的作用及其与突变型P53的关系

肖永志，刘英哲，冯雪萍，易文君

（中南大学湘雅二医院 1.超声科 4.乳腺外科，湖南 长沙 410011；中南大学湘雅医院 2.国际医疗部/国家老年疾病临床医学研究中心 3.医学实验中心，湖南 长沙 410008）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。严重威胁到了女性的健康和生活。在2012年，全球大约有170万人患病，其中有521 900人死亡[1]。在中国，乳腺癌是女性第五大致死性癌症[2]。乳腺浸润性导管癌（IDC）是乳腺癌中最常见的病理类型[3]。IDC的发生主要考虑与基因调控异常及性激素水平的紊乱有关，生物学因素的改变，可以影响到肿瘤相关信号通路的激活，导致早期细胞发生病变[4]。现阶段IDC患者的早期诊断的水平仍然较为局限，影像学筛查虽然能够提高诊断准确率，但漏诊率或者误诊率仍然较高[5]；临床上通过手术及综合性的放疗方式辅助治疗IDC，但其治疗后患者的生存时间的改善并不理想，治疗后的3年生存率并无明显的提高[6]。虽然手术、放疗、化疗是肿瘤治疗的传统手段[7]，但免疫治疗目前已经成为治疗肿瘤的新的方法，如PD-1/PD-L1抑制剂[8]等，备受人们关注。

犬尿氨酸酶（kynureninase，KYNU）或L-犬尿氨酸水解酶属于犬尿氨酸酶家族，基因组位置在2q22.2[9]。KYNU在肝脏、胎盘、肺、心脏、脑等多种组织器官中均有表达[10]，能水解L-犬尿氨酸和3-羟基L-犬尿氨酸为邻氨基苯甲酸，通过色氨酸代谢通路参与NAD辅因子的生物合成[11-12]。色氨酸在肿瘤细胞中主要通过吲哚胺-2-3双加氧酶1（IDO-1）降解，其降解产物之一为犬尿氨酸。

人类许多肿瘤的发生、发展都与p53基因的突变有关。P53蛋白也是多种癌症进展与预后的一项重要指标[13]。因此，本研究应用免疫组织化学方法检测IDC标本中KYNU和突变型P53的表达情况，分析它们与IDC临床病理特征的相关性，进而探讨它们之间的相互关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源从2012年9月—2015年在湘雅二医院接受外科介入和病理检查的IDC患者石蜡包埋标本。从患者的记录中回顾性地获得这些患者的临床和病理数据。

1.1.2 抗体KYNU抗体购自GeneTex公司（兔多克隆抗体，GTX33291），适用的稀释浓度为1:1 000；使用UltraViewTMUniversal DAB检测试剂盒（Ventana Medical Systems）常规染色针对P53的单克隆抗体。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化肿瘤组织放入10%福尔马林中固定，并包埋在石蜡块中，蜡块作厚度约4 μm的多张切片，其中1张行切片HE常规染色，另2张切片分别行KYNU、P53免疫组化检测，且HE常规染色均由湘雅二医院病理科高年资医生病理检查证实。采用SP法检测KYNU的表达，检测方法按试剂盒说明书进行。以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。P53使用自动Benchmark平台（Ventana Medical Systems，Tucson，USA）进行免疫组化实验（37 ℃孵育60 min）。使用Benchmark平台对所有标本使用细胞调节溶液（CC1，Ventana Medical Systems）的抗原修复，并用苏木精进行复染。

1.2.2 结果判断根据美国临床肿瘤学会（ASCO）和美国病理学家学会（CAP）指南对P53染色进行评分。P53阳性定义为超过10%的肿瘤细胞染色。KYNU蛋白主要在肿瘤细胞的细胞质中表达。细胞质染色分数（CF）的得分为0（0～5%），1（5%～25%），2（26%～50%），3（51%～75%）或4（＞75%），细胞质染色强度（CI）记为0（阴性）、1（弱）、2（中等）、3（强）。随后，通过将CF和CI（范围0～12）相乘来计算组合的细胞质评分（CS）。为了合理进行统计分析，减少异质性，使用对数秩和检验选择KYNU表达的临界范围值。最佳临界范围值被确定为低表达（分数≤4）或高表达（分数＞4）KYNU表达。

1.3 统计学处理

使用Windows版的SPSS 19.0版进行统计分析。使用χ2检验评估KYNU表达与临床病理学特征之间的关系。使用单因素方差分析计算KYNU在IDC的肿瘤分级和TNM分期中的表达数据。

2 结果

2.1 KYNU在IDC中的表达

在131例IDC组织中进行KYNU的免疫组化分析，63个样本（48.1%）KYNU高表达（IHC得分＞4），68个样本（51.9%）为KYNU低表达（IHC得分≤4）。在102例IDC组织中，46个样本P53表达阳性，阳性率为45.1%，56个样本P53表达阴性（图1）。

图1 免疫组化检测KYNU与P53蛋白表达（×400） A：乳腺癌组织中KYNU高表达；B：乳腺癌组织中KYNU低表达；C：乳腺癌组织中P53阳性表达；D：乳腺癌组织中P53阴性表

2.2 KYNU在IDC中的表达及与临床病理指标的关系

单因素分析结果显示，KYNU的表达T分期（P＜0.001），组织学分级（P=0.01），内在亚型（P=0.032），突变型P53（P=0.02）有关，而与年龄及N分期无关（均P＞0.05）（表1）。

表1 KYNU表达与IDC临床病理特征的相关性

3 讨论

在本研究中，通过免疫组化的方法探讨了KYNU在IDC的表达及其对预后评估的价值。KYNU主要在细胞胞浆中表达，它的表达与乳腺癌病理分型相关，在不同分级中表达强弱有差异，组织学分级I级表达最强，组织学分级II级其次，组织学分级III级表达最弱。KYNU的表达在不同分期中表达强弱也有差异，T0表达最强，T3表达最弱。

而在乳腺癌的亚型中表达可见，高KYNU表达多存在于luminal A型，而不是三阴型；而低KYNU表达则多存在于三阴型，而三阴型乳腺癌是一种特殊类型的乳腺癌亚型，具有发病年龄小、家族史、有淋巴结转移等特点，其较早发生局部复发和远处转移[14]，故从肿瘤的分期、分级及不同亚型的分析来看，KYNU的表达与肿瘤的侵袭性负相关。

笔者推测KYNU作为色氨酸代谢途径中另一关键酶在IDC发生与发展中起重要的作用。KYNU与色氨酸的利用和疾病的代谢有关，而色氨酸代谢中的重要酶，吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）与恶性肿瘤的免疫耐受密切相关[15]。一项髓质乳腺癌患者的研究表明，IDO-1的高表达与肿瘤良好的预后相关[16]。犬尿氨酸酶在癌症发展中的作用尚不十分清楚，其与癌症的关联仅有少量报道，如肺癌[17]。也有研究表明它与乳腺癌细胞的增殖和分化密切相关[18]。

人体内野生型p53基因作为抑癌基因，主要生物学功能为引起细胞周期阻滞，诱导凋亡和促进分化[19]，但因其含量少，半衰期短而不能用免疫组化法测出。突变型P53蛋白失去抑癌作用，反而有促进细胞恶变的活性，由于其半衰期延长，且在细胞核内聚积，通过免疫组化方法可直接检测[20]。人类恶性肿瘤中多数存在p53基因突变[21]，p53基因突变可导致缺陷DNA大量复制，甚至导致恶变[22]。

临床上乳腺恶性肿瘤的发生，导致患者生活质量和生存时间显著下降[23]。在探讨IDC的发病机制的过程中发现，P53蛋白能够通过影响到癌细胞的周期调控，导致上皮细胞的持续性增殖，提高了癌细胞对于导管基底部的浸润作用[24]。在浸润性导管癌患者病灶组织中，P53的表达阳性率显著的上升，高于正常对照乳腺组织，差异较为明显，提示了P53可能影响到了乳腺癌发生[25]。

在KYNU与肿瘤相关指标P53的关系分析中可见，KYNU高表达与P53（突变型）呈反向变化关系。还有报道也认为，在乳腺癌患者病灶组织中，P53的表达阳性率可平均上升30%以上，同时在临床分期较晚或者远期病死率较高的导管癌患者中，P53的表达阳性率可进一步的上升[26]。

恶性肿瘤是一个多因素、多步骤作用的结果，其发生要经过一系列基因表达变化的共同作用。基于笔者的上述数据，KYNU可能对乳腺癌起到了抑制作用，它的高表达可被认为是具有良好预后的IDC的标志物。因此KYNU是很有前途的乳腺癌治疗靶点，但需要对KYNU进行更深入的研究。未来将对影响乳腺癌发展的KYNU分子机制进行更进一步的研究。