CircRNA在系统性红斑狼疮和类风湿关节炎的研究进展①

招春飞 李文生 廖淑珍 王思捷 刘华锋 潘庆军

(湛江市慢性肾脏病防控重点实验室，广东医科大学附属医院肾脏疾病研究所，湛江 524001)

自身免疫性疾病(autoimmune diseases,AID)指机体的免疫系统对自身的组织结构抗原产生免疫应答，进而造成自身组织损害所引起的一类疾病，典型疾病包括系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)和类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)等。SLE是一种女性高发，特别是育龄期女性，可累及多系统的(肾脏、皮肤、血液、神经系统等)，高度个体化的自身免疫性疾病[1,2]。RA是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病。其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失[3,4]。

非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)是不能编码蛋白质的RNA，各种生命体内广泛存在，具有调控生命活动的作用。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类特殊的非编码RNA，在真核细胞中广泛存在，为闭合环状结构的RNA，与线性RNA不同，其由前体RNA(pre-mRNA)的3′末端和5′末端共价结合形成的内源性ncRNA，具有物种间序列保守和结构稳定，以及细胞或组织特异性表达等特征[5]，在过去被认为是错误剪接所产生的。据现有文献报道，circRNA主要有3 种来源形式：第一种仅由外显子组成的外显子环状RNA(exonic circular RNAs,ecircRNAs)是通过5′端-3′端连接成环，片段大小各异，可充当竞争性内源RNA(ceRNA)结合天然微小RNA(miRNA)并阻断其对靶基因表达的抑制作用，如作为miRNA的分子“海绵”发挥功能[6-9]；第二种源自内含子套索的circRNA是通过5′-2′末端连接成环，片段大小各异，存在较稳定[10]；第三种同时包含外显子和内含子的circRNA(eIciRNAs)，其片段大小为250～400 nt[11]。近年来，circRNA在SLE和RA中的研究备受关注[12]，研究发现，circRNA可通过多种途径发挥作用：可充当为miRNA的分子海绵(miRNA sponge)调控其表达[13-15]；参与调节基因的转录[16-18]；与蛋白结合互作调节[19,20]；参与蛋白翻译等生物学功能[21-23]。由此，circRNA具备强大的生物学功能，其在SLE和RA发病中的作用和机制，概述如下。

1 circRNA与系统性红斑狼疮

SLE的发病主要由遗传背景和环境互作介导，近年发现，SLE在血浆、PBMC或肾组织等组织中的circRNA表达异常[24]，并可通过多种模式，如作为miRNA sponge调控其表达等参与SLE发病[25,26]。

有研究报道，SLE患者PBMC中circIBTK源自IBTK基因位点的hsa_circ_0077179，表达显著下调，并与SLEDAI评分、抗dsDNA抗体呈负相关[27]，与补体C3水平呈正相关；SLE患者中miR-29b的表达显著上调，并与SLEDAI评分、抗dsDNA抗体水平呈正相关，与补体C3水平则呈负相关。另外，miR-29b可诱导DNA去甲基化[28-30]，可能与SLE患者常见的DNA去甲基化相关[31,32]。且miR-29b诱导DNA去甲基化后，可激活AKT信号通路，而circIBTK可能通过与SLE患者中的miR-29b结合，抑制miR-29b诱导的DNA去甲基化，从而阻止AKT信号通路的激活[27]。有研究证明SLE患者淋巴细胞中Akt-473和GSK3β(ser9)的磷酸化水平升高，Akt-GSK3β信号通路的异常激活增加了狼疮淋巴细胞的增殖[33]。另有研究证实了SLE患者所有B淋巴细胞亚群中Akt-1(PKB)的磷酸化增加，这是PI3激酶的关键下游靶标，PI3激酶调节增殖、存活和分化，PI3激酶活性受损会导致免疫缺陷，而其活性增强会导致自身免疫性疾病[34]。PTEN在SLE患者中低表达，PTEN表达水平与疾病活动呈负相关[32]。此研究发现PTEN可能是miR-29b的潜在靶标，并验证了circIBTK的上调促进了PTEN的表达并抑制了AKT的磷酸化，miR-29b的过表达显著减弱了circIBTK诱导的PTEN表达的增加和AKT信号通路的失活，因此，circIBTK的下调导致PTEN表达降低，从而增加AKT的磷酸化；敲低miR-29b后可以显著逆转circIBTK抑制诱导的PTEN下调和AKT信号通路的激活[27]。综上提示，circIBTK和miR-29既可作为SLE的生物标志物，也可作为潜在的治疗靶点。

Luan等[35]研究了初发狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)患者的肾组织中的circRNA谱和circRNA与miR-150之间的相互作用。在人肾组织中共鉴定出18 505个circRNA，与正常的肾组织相比，LN患者中有11 411个上调和7 094个下调的circRNA，其中171个在两组之间差异显著。选择142个显著上调的circRNA进行GO富集分析，发现其参与多种生物学功能，如调节树突状细胞(DC)的分化、细胞质mRNA加工体的组装、MHC蛋白复合物和肽抗原的结合等。研究显示，过表达的circRNA可能通过调节上述生物学功能在LN的发病中起作用。KEGG分析揭示了缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路和神经营养因子信号通路都参与调节NF-κB的表达，而NF-κB可通过增加炎症反应而促进LN的进展[36]。此研究发现7个验证的circRNA包括circHLA-C、circZNF609、circEKL4、circFAM188A、circUBR5、circPDE4B和circSP100在LN组织中显著上调。其中，circHLA-C与24 h尿蛋白排泄率、总肾小球中新月体肾小球占的百分比和肾脏活动指数呈显著正相关，有与血清肌酐呈正相关的趋势，与LN疾病活动度呈正相关，研究提示，circHLA-C可能参与LN的发病。该课题组还发现circHLA-C和miR-150存在负相关，并存在相互结合的位点。在新发的Ⅳ期LN患者中，发现上调的circHLA-C可能通过结合miR-150，促进肾脏损伤，包括肾小球中新月体的形成和蛋白尿的排泄等。综上提示，circHLA-C可能通过分子海绵miR-150在LN的发病中发挥重要作用[35]。

Li等[37]报道，大量circRNA在SLE患者与正常人血浆存在差异表达，包括113个上调和94个下调等，其中，has_circ_102584、has_circ_400011和has_ circ_101471在SLE患者中显著上调，has_circ_100226在SLE患者中显著下调。Zhang等[38]也报道了血浆和PBMC中有112个circRNA存在差异表达，包括53个上调和59个下调，其中hsa_circRNA_407176和hsa_circRNA_001308在SLE患者血浆和PBMC中下调，hsa_circRNA_001308的表达与血浆中的CRP和抗SSA及PBMC中的白细胞减少相关，hsa_circRNA_406567与血浆中的抗RNP相关。Li等[39]在SLE患者和健康对照组T细胞的circRNA表达谱中发现127个差异表达的circRNA，其中hsa_circ_0045272在SLE患者T细胞中显著降低，hsa_circ_0045272可能通过下调其特定的ceRNA NM_003466(PAX8)的表达而负调控T细胞凋亡和IL-2的产生，提示hsa_circ_0045272在T细胞活化中发挥重要作用[39]。

Miao等[40]通过RNA高通量测序(RNA-seq)分析SLE患者和健康人PBMC circRNA的表达，选择了两个上调的circRNA(circLRRK2和circPPHLN1)和两个下调的circRNA(circPTPN22和circMY-BL1)，确定了一个从未发表的circRNA，此circRNA命名为circPTPN22，是蛋白酪氨酸磷酸酶非受体22型(PTPN22)的亲本基因，PTPN22已被反复证明与SLE有关[41,42]。此研究结果显示SLEDAI评分高患者比SLEDAI评分较低患者的circPTPN22表达水平要低，所有SLE患者治疗前circPTPN22的表达水平比健康对照组的低，反映了circPTPN22表达水平与SLE患者的SLEDAI得分呈负相关[40]；此外SLEDAI评分较高的患者经过长期激素治疗可显著提高circPTPN22水平，因此推断circPTPN22不仅与SLE疾病严重程度显著相关，而且还可能反映了SLE患者的治疗效果。但是其临床意义和潜在机制仍未明确，例如，总淋巴细胞、单核细胞和/或CD4+或CD8+T细胞是否表达相同水平的circPTPN22,治疗是否会引起这些细胞亚群数量的任何变化。

Zhang等[43]在SLE患者和健康对照组CD4+T细胞经过circRNA基因芯片分析得到circRNA表达谱。SLE患者组中有12个circRNA上调，而2个circRNA下调。SLE患者hsa_circ_0012919水平比健康对照组显著上调，SLE患者合并关节损害、LN、抗dsDNA(+)、抗Sm(+)、C3或C4缺乏症的hsa_circ_0012919表达明显高于无这些症状的患者，hsa_circ_0012919表达与C3和C4水平呈负相关，并且未接受药物治疗的患者的hsa_circ_0012919表达明显高于治疗后的患者。数据显示hsa_circ_0012919与CD70和CD11a表达呈正相关，与DNMT1的表达呈负相关，推测hsa_circ_0012919可能与SLE的CD4+T细胞DNA甲基化异常有关。此研究发现hsa_circ_0012919和miR-125a在细胞质中共定位，表明hsa_circ_0012919与miR-125a结合，hsa_circ_0012919与狼疮CD4+T细胞中miR-125a-3p的表达呈负相关。一些学者证明了miR-125a可以调控RNATES和KLF13，而miR-125a-3p可以作为miR-125a的活性片段，因此推测hsa_circ_0012919通过miR-125a-3p来调控RNATES和KLF13。并发现hsa_circ_0012919与狼疮CD4+T细胞中RNATES和KLF13的表达呈负相关，而miR-125a-3p降低了RNATES和KLF13的表达，hsa_circ_0012919逆转并增加了RNATES和KLF13的表达。为了证明hsa_circ_0012919与miR-125之间存在直接关系，进行了剂量依赖性实验。结果表明，RNATES和KLF13的表达呈剂量依赖性，受miR-125和hsa_circ_0012 919的影响[43]。以上结果表明hsa_circ_0012919可能通过miR-125a调控KLF13和RANTES。因此hsa_circ_0012919可作为SLE的生物标记物，hsa_circ_0012919是miR-125a-3p的ceRNA。

2 circRNA与RA

RA是一种慢性全身性自身免疫疾病，其特征为慢性关节炎，主要损伤关节滑膜，导致关节进行性损伤、残疾和死亡[44]。其病因迄今为止尚不明确。环境因素、遗传背景以及IL-27、IL-35、TNF-α等促炎因子已被证实与RA的发病有关[45,46]，circRNA可作为miRNA的分子海绵发挥其生物学功能调节RA的发病机制。circRNA在RA中的研究刚刚兴起，其在RA的诊断和治疗中都可能发挥重要作用。

最近报道，在RA患者与健康人的PBMC中，检测到12个差异表达的circRNA，其中9个上调，3个下调[47]。circRNA微阵列分析和qRT-PCR验证鉴定出RA患者PBMC中的circRNA_092516、circ-RNA_003524、circRNA_103047、circRNA_104871和circRNA_101873表达与来自健康对照组呈显著差异并上调，表明这些circRNA可能参与RA的发病。虽然，这些差异表达的circRNA与疾病活动评分(DAS28)、红细胞沉积率(ESR)、C反应蛋白(CRP)和健康评估问卷(HAQ)无关，表明这些circRNA可能不是RA患者疾病严重性或全身性炎症的相关生物标志物，但这些circRNA的表达水平存在部分相关，例如circRNA_003524的表达水平与circRNA_103047相关。为了评估显著差异表达的circRNA对RA诊断的潜在价值，Ouyang[47]进行了ROC曲线分析。确认的circRNA的ROC曲线显示PBMC中circRNA_104871、circRNA_003524、circRNA_101873和circRNA_103047的水平可以将RA患者与健康对照组区分，并发现circRNA_104871的AUC值最高(AUC：0.833,95%CI 0.721-0.944，P<0.001)，因此，其显示出最高的ROC AUC值，表明circRNA_104871具有诊断RA生物标志物的高潜力。这些circRNA可能存在直接或间接相互作用，这需要进一步的实验来验证。

另有报道，与健康人比较，RA患者外周血血浆中circRNAs(如hsa_circ_0054189，hsa_circ_0008675，hsa_circ_0082689，hsa_circ_0082688，hsa_circ_0010932，hsa_circ_0002473和hsa_circ_0044235)的表达，只有hsa_circ_0044235显著减少[48]，推测hsa_circ_0044235可能与RA有关，但其水平与类风湿因子(RF)、抗胆碱蛋白抗体ACPA、 CRP、 ESR和DAS28无关，表明外周血中的hsa_circ_0044235可能不能用作RA中全身性炎症或疾病活动的标志物。但该研究发现外周血hsa_circ_0044235的AUC高达0.779,基于外周血的hsa_circ_0044235风险评分表明，其表达水平可以有效地区分RA患者与SLE患者，提示外周血中的hsa_circ_0044235可以特异性识别RA患者，并且诊断准确性更高。经靶标软件预测，hsa_circ_0044235具有hsa-miR-892a、hsa-miR-135b-5p和hsa-miR-135a-5p三个miRNA靶标，经RA患者外周血检测发现，仅has-miR-892a的表达水平显著升高[48]。推测hsa_circ_0044235可能通过与hsa-miR-892a相互作用，参与RA发病，当然需要进一步的研究来证实这一假设。

另有报道，通过提取RA患者和健康对照组PBMC的总RNA，并进行circRNA表达谱分析，发现RA患者的PBMC中的hsa_circ_0092285、hsa_circ_0058794水平显著上调，而hsa_circ_0088088、hsa_circ_0038644水平则显著下调。hsa_circ_0088088是RA中最显著下调的circRNA，hsa-miR-16-5p是hsa_circ_0088088的miRNA反应元件(MRE)之一，意味着hsa-miR-16-5p显著增加；RA患者中，miR-16主要与疾病的活动程度相关，例如ESR、CRP、关节压痛计数(TJC)和TNF-α、DAS28等指标呈正相关；因此可以推断hsa_circ_0088088可能通过miR-16在RA的发病机理中起重要作用[49]。尽管该研究未针对RA的病理生理和分子机制选择和验证特定的circRNA，但该研究可能为RA的早期诊断和发病机理提供新的观点，circRNA在RA的发展和进程中的作用机制需要进一步深入研究。

3 展望

新近发现，SLE和RA患者血清和细胞中部分circRNAs的水平显著上调或下调，其一方面可作为SLE和RA诊断或疾病活动度判断的新型生物标志物，另一方面可通过与microRNA等靶标相互作用，参与其发病，但其机制尚不完全清楚，仍需系统和深入地研究其具体表达和调控的分子机制。总之，靶向circRNA有望为SLE和RA的诊断及治疗提供新思路。