血小板Toll样受体在血栓形成中的研究进展

曹 杰，杨人强

南昌大学第二附属医院心血管内科，南昌 330006

血小板在止血、血栓形成、免疫炎症过程中起重要作用。血小板表达多种受体，这些都有助于血小板功能反应。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫受体，可通过识别配体参与细胞的免疫应答和炎症反应。而炎症反应和血栓形成之间存在密切联系。血小板可通过特定的受体识别循环中的病理配体，并将信号转化为血栓形成前状态。大量研究表明，血小板TLRs对血小板活化聚集及促进血栓形成有显著的影响，本文总结了血小板中TLRs在血栓形成中的作用及与相关疾病的关系。

TLRs

TLRs是一种表达于单核细胞、巨噬细胞、血小板、树突状细胞和中性粒细胞等固有免疫细胞的模式识别受体，通过特异识别病原体上的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)激活细胞内信号转导，诱发机体免疫应答反应。TLRs属于Ⅰ型跨膜蛋白，可分为胞膜外区、胞浆区和跨膜区3部分。胞膜外区由富含亮氨酸的重复序列(leucine rich repeat，LRR)组成，主要与配体识别有关。胞浆区因与白细胞介素1受体(interleukin-1 receptor，IL-1R)同源，称为Toll/IL-1R受体结构域(toll/IL-1R，TIR)。TIR结构域高度保守，通过募集下游接头分子决定TLR信号通路的特异性。跨膜区是一段富含半胱氨酸的结构域，跨细胞膜连接TLR的胞膜外区与胞浆区。2004年，Shiraki等[1]首次通过逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)证实人血小板和Meg-01(巨核细胞株)表达TLRs家族。2005年，Andonegui等[2]首次证实人血小板表达功能性的TLR4。迄今为止，已在小鼠中发现13种TLRs(TLR1～13)，人类发现有11种TLRs(TLR1～11)。Koupenova等[3]发现人类血小板表达10种TLRs，并有性别差异，女性较男性表达更高的血小板TLRs。人血小板表达多种功能性TLRs，如TLR2、TLR4、TLR7和TLR9，其与血栓形成具有密切的联系。

TLR2TLR2定位于细胞膜，是TLR家族中识别PAMPs最多的成员，可通过与TLR1或TLR6形成异质二聚体识别配体。TLR2表达范围最广，可在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞等表达。2009年，Blair等[4]首次证明人血小板能够表达识别细菌成分的功能性TLR2，并能通过磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3-K)/丝氨酸苏氨酸激酶(protein kinase B，Akt)信号转导途径激活血小板和炎症途径形成血栓。Liu等[5]研究表明，B族链球菌通过血小板TLR2激活PI3-K/Akt，引发α颗粒的释放和整合素GPⅡb/Ⅲa的活化，从而诱导血小板活化聚集。Biswas等[6]发现羧基烷基吡咯-磷脂酰乙醇胺衍生物(carboxyalkylpyrrole-phosphatidylethanolamine derivatives，CAP-Pes)，一种氧化修饰的磷脂，也可通过血小板TLR2激活血小板促进血栓形成。他们还在后续研究中发现，氧化磷脂oxPCCD36结合血小板CD36，诱导CD36与TLR2/TLR6形成复合物，激活血小板加速血栓形成，表明血小板TLR2在血小板高反应性和高脂血症引起的促血栓形成中发挥关键作用[7]。然而Assinger 等[8]发现，人巨细胞病毒可通过血小板TLR2诱导血小板激活，促进血小板白细胞聚集、炎症和血管生成，从而加剧组织损伤，促进动脉粥样硬化形成，不引起血小板黏附和聚集形成血栓，与上述研究有别。

TLR4TLR4是发现最早、研究最广泛的TLR，定位于细胞膜上。TLR4可识别革兰阴性细菌产生的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、内源性配体如组蛋白、高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1，HMGB1)、热休克蛋白和脂磷壁酸等。2005年，Andonegui等[2]首次报道人血小板表达功能性的TLR4，且血小板TLR4介导LPS诱导的循环血小板减少和肺中血小板聚集。随后有研究发现，在严重的全身感染时，血小板通过TLR4与中性粒细胞紧密结合，快速形成嗜中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NET)，NET在流动条件下保持其完整性并在脉管系统内诱捕细菌，但这种抗菌作用是以损伤内皮和组织为代价[9]。Fuchs等[10]发现，NET为血小板聚集提供刺激和支架，可促进血栓形成。组蛋白是NET的主要成分，通过血小板依赖性机制诱导凝血酶生成促进血栓形成，且血小板TLR2和TLR4参与组蛋白诱导的血小板活化[11-12]。研究还发现，血小板衍生的HMGB1是形成血栓的关键介质，而HMGB1可通过血小板TLR4促进血小板聚集和血栓形成[13]。此外血小板TLR4还可以介导含有额外结构域A的细胞纤连蛋白(cellular fibronectin containing extra domain A，Fn-EDA+)[14]、血小板Nod样受体蛋白3(nod-like receptor protein 3，NLRP3)[15-16]炎性小体，导致血小板活化聚集促进血栓形成。

TLR7TLR7定位于细胞内，主要识别病毒单链RNA(single-stranded RNA，ssRNA)。2014年，Koupenova等[17]首次报道血小板表达功能性的TLR7，且血小板中TLR7的激活在介导血小板-病毒免疫应答是必需的。病毒感染的早期阶段，血小板TLR7的激活可直接导致血小板计数减少，并影响病毒感染宿主的存活，然而血小板TLR7的激活不会诱导血小板聚集，尽管血小板TLR7的激活增加了血小板对胶原的黏附，但其并不促进血栓形成，对血栓形成没有直接影响，这与其他TLRs受体有别。

TLR9TLR9定位于细胞内，可在静止的人血小板质膜和细胞质中表达，且在用凝血酶激活血小板后表达增加。血小板活化后血小板分泌增强，释放的蛋白产物协调动态免疫和炎症应答。而血小板分泌的蛋白质大部分最初被认为储存在3种类型的储存细胞器中：α颗粒、致密体和溶酶体。最近Thon等[18]发现了第4个称为T颗粒的电子致密管状系统隔室，有趣的是TLR9和蛋白质二硫键异构酶共定位在T颗粒。Panigrahi等[19]研究发现，羧基(烷基吡咯)蛋白加合物，[carboxy(alkylpyrrole)proteins，CAPs]，一种氧化应激产生的配体，可作为TLR9的新配体，CAPs通过TLR9/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)途径诱导血小板活化、颗粒分泌，促进血小板体外聚集以及体内血栓形成，表明血小板TLR9是一种功能性血小板受体，其可将氧化应激、血栓形成和先天免疫联系起来。

血小板TLRs的信号转导途径

TLRs识别PAMPs后，TIR募集特定的接头分子激活下游的转录因子，引发免疫反应。在有核细胞中，TLRs主要有两个不同的信号通路：MyD88依赖途径和MyD88非依赖途径。MyD88依赖途径：TLR识别配体后发生二聚化，募集接头分子MyD88，MyD88与丝/苏氨酸蛋白激酶(IL-1 receptor associated kinase，IRAK)家族结合，导致IRAK自身磷酸化，磷酸化的IRAK脱离MyD88与肿瘤坏死因子受体相关因子-6(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6，TRAF-6)结合，使转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)活化酶1(TGF-β activated kinase 1，TAK1)激活。TAK1激活后有两条不同的信号转导途径；(1)核转录因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)途径；(2)丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)信号分子转导途径。MyD88非依赖途径：MyD88非依赖途径主要由TLRs相关的干扰素活化因子(TIR domaincontaining adaptor inducing interferon-β，TRIF)介导，诱导产生干扰素和炎性细胞因子。

然而有研究表明，血小板也表达NF-κB[20]。随后研究发现，NF-κB是血小板活化的介质，且NF-κB是TLR2和TLR4介导血小板效应的关键下游介质[21-23]。Berthet等[24]研究发现，血小板表达TLRs在有核细胞信号转导的大多数分子，如MyD88、TRIF、IRAK-1、MAPk、TRAF6和NF-κB等。Zhang等[25]研究也表明，血小板表达LPS受体-信号传导复合物的必要成分包括TLR4、髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2，MD2)和MyD88，且LPS可通过TLR4/MyD88信号转导复合物刺激血小板分泌和聚集。上述研究表明，血小板含有有核细胞通过TLRs进行信号转导所需的大部分蛋白质，似乎血小板与有核细胞具有相同的机制，但情况并非如此。因为MyD88依赖和MyD88非依赖途径最终导致转录因子的激活和核转位，而血小板是无核细胞，基因转录是不可实现的。TLRs如何在血小板进行信号传导，其机制仍未完全阐明。在无核血小板中，TLRs还存在其他信号传导途径。Hazeki等[26]研究发现，TLRs在多种免疫细胞中可激活PI3-K/Akt信号通路。而在血小板中，PI3-K/Akt通路可广泛调节血小板功能，包括血小板黏附、分泌和聚集[27]。Blair等[4]研究证实，TLR2可激活人血小板中PI3-K/Akt信号传导途径，而PI3-K/Akt能调节TLR2介导的血小板功能反应，包括血小板聚集、黏附、分泌、白细胞相互作用和活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生。Fälker等[28]研究发现，TLR2/1复合物激活剂Pam3CSK4通过Src和Syk家族的酪氨酸激酶，活化T细胞接头蛋白(linker for activating T cell，LAT)以及磷脂酶 Cγ2(phospholipase C isoform γ2，PLCγ2)引起人血小板的活化和聚集。Zhang等[25]研究证实，LPS通过TLR4-MyD88和环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)/cGMP依赖性蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase，PKG)途径，刺激血小板颗粒分泌，导致血小板活化和聚集增强。Vogel等[13]研究也发现，血小板TLR4可通过cGMP依赖性蛋白激酶 Ⅰ(cGMP-dependent protein kinase Ⅰ，cGKⅠ)途径介导血小板活化和聚集。LPS通过TLR4-PI3K/Akt-细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)-磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)增加人血小板活化，该途径依赖于ROS和血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)的形成[29]。CAPs作为TLR9的新配体，可通过TLR9/MyD88/IRAK1信号传导诱导血小板活化，PI3-K/Akt和Src家族激酶也参与其中[19]。上述研究表明，血小板TLRs可通过多种信号途径调控血小板功能，促进血栓形成，但其机制尚不完全清楚，仍有待进一步研究。

血小板TLRs与血栓性疾病的关系

脓毒症脓毒症是继发于感染引起的全身炎症反应综合征，凝血功能紊乱是脓毒症重要的发病机制，而由凝血异常导致的血栓是脓毒症的常见并发症。Stark等[30]研究表明，血小板的TLR4足以促进内毒素血症中的微血管血栓形成，然而其并不伴有全身性炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)和白细胞介素(interleukin，IL)-1β的增加，促血栓形成和炎性细胞因子的解离为血小板TLR4的作用机制提供了新见解。HMGB1是一种内源性损伤相关模式分子，在凝血异常疾病的发病中至关重要。Vogel等[13]研究发现，血小板衍生的HMGB1是血栓形成的关键介质，活化血小板释放的HMGB1通过血小板TLR4/MyD88和鸟苷酸环化酶(GC：第二信使cGMP的NO信号传导途径的关键酶)形成MyD88/GC复合物，诱导血小板中的cGK1，从而介导血栓形成和血小板聚集。最近研究发现，细胞外组蛋白在脓毒症发病过程中也发挥重要作用，组蛋白具有促进血液凝固和凝血酶形成的能力，脓毒症时免疫细胞激活释放NETs、细胞坏死均可导致细胞外组蛋白浓度升高。而Xu等[31]研究发现，组蛋白是脓毒症患者死亡的主要介导者，其介导了凝血功能紊乱。Semeraro等[12]研究发现，组蛋白可通过血小板依赖性机制直接促进凝血和凝血酶形成，进而影响脓毒症血栓形成，且血小板TLR2和TLR4参与其中。这些研究表明，血小板的TLRs可直接或间接参与脓毒症血栓的发生发展。

急性冠脉综合征Gurses等[32]首次报道急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)患者血小板的TLR2和TLR4表达增加，且通过TLRs的自身配体可引起血小板活化，这可能导致ACS患者的促血栓状态形成。Hally等[33]也发现，在ACS患者中血小板TLR9的表达增加。Hally等[34]随后在急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者中也发现血小板TLR1和TLR4表达上调，且血小板TLR2/1复合物能够直接以剂量依赖性地诱导血小板活化，表明血小板TLR2/1复合物可能是AMI中的替代血小板激活途径。进一步研究表明，阿司匹林和替格瑞洛的联合抗血小板治疗不能完全抑制TLR激动剂引起的血小板活化，表明目前的抗血小板治疗不能完全抑制血小板TLRs引起的血小板活化，血小板TLRs通路可能是抗血小板治疗后的替代性血小板激活途径，有助于AMI患者发生再发缺血性心血管事件[35]。以上研究表明，血小板TLRs与急性冠脉综合征的发生发展有密切联系。

综上所述，血小板表达多种功能性TLRs，其参与并介导血小板的功能反应，进而影响血栓形成，在血栓相关的疾病中扮演重要角色。然而血小板TLRs的作用机制尚未完全阐明，虽然血小板表达有核细胞信号转导途径的信号蛋白，但其是否有功能尚未阐明。深入了解血小板TLRs的信号转导，能更好地理解TLRs在血小板功能的作用，血小板TLRs及其信号通路可能成为治疗血栓性疾病的新靶标。