益生菌调控mTORC1信号通路干预骨质疏松的相关研究进展

尹晨飞，孙海飚，张子楠，冯志国，韩晓强

（1．山西医科大学，山西 太原 030001；2．山西医科大学第一临床医院，山西 太原 030001）

骨质疏松症可增加患者骨折的风险，导致死亡率升高。尽管使用了诸多促进骨骼健康的治疗方法，但是全球骨质疏松症患者的数量仍在增加。传统的药物治疗具有副作用，目前益生菌在治疗骨质疏松方面表现出光明的前景，可以通过调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1）信号通路干预骨质疏松。本文通过回顾近些年的相关研究结果，综述骨、益生菌和mTORC1 之间的关系。

1 骨质疏松症

骨质疏松症是一个世界性难题，已经成为一种越来越常见的慢性骨骼疾病，全世界＞2 亿患者受其影响[1]。其主要特征是骨密度和骨质量的进行性下降，以及骨微结构的破坏，这些改变导致了骨折的风险增加[2]。因此，骨质疏松症的早期诊断、预防和治疗都极为重要[3]。尽管已使用了诸多促进骨骼健康的治疗方法，但全球骨质疏松症患者的数量仍在增加。美国最新数据显示，美国＞50 岁成年人中10.3%患有骨质疏松症，43.9%成年人有骨量降低[4]。目前治疗骨质疏松主要依赖传统药物，但是这些药物并不总是有效，并且带来了相当大的安全问题[5]。因此，寻找增加骨形成和维持骨强度的替代疗法至关重要。

2 mTORC1 信号通路

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）是哺乳动物体内的一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可以形成mTORC1 和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2（mammalian target of rapamycin complex 2,mTORC2）。mTORC1 与mTORC2 的区别在于对雷帕霉素的不同敏感性：mTORC1 对雷帕霉素更敏感，它整合了多种细胞内和细胞外信号，包括Wnt、胰岛素/胰岛素样生长因子-1、氧、能量、应激或氨基酸水平等信号分子，通过多种下游效应器调节细胞生长和代谢[6]。雷帕霉素是一种从土壤链球菌中提取的大环内酯类化合物，与相对分子质量为12 kD 的FK506结合蛋白具有高亲和力，其形成的复合物可作用于mTOR，从而抑制mTORC1[7]。结节硬化蛋白复合物（tuberous sclerosis complex, TSC）是mTORC1 信号通路上游的一个关键调节器，包括TSC1 和TSC2 两种形式，是一种鸟苷三磷酸（guanosine triphosphate, GTP）酶激活蛋白，可以激活小G 蛋白Rheb 的GTP 酶活性，从而促进Rheb/GTP 结合态向Rheb/GDP 结合态转化，TSC1/TSC2 磷酸化会抑制这种作用，从而导致胞质中Rheb/GTP 的聚集[8]；而Rheb/GTP 结合态会使mTORC1 发生磷酸化而激活[9]。mTORC1 的下游信号分子主要包括70 kD 的核糖体蛋白S6 激酶（ribosomal protein S6 kinase, P70S6K）、真核翻译起始因子4E 结合蛋白1（eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1, eIF4E-BP1）。活化的mTORC1 使eIF4E-BP1 和P70S6K 发生磷酸化，导致细胞内蛋白质、脂质生物合成增加，促进细胞分化增殖[10]。

3 研究现状

目前许多实验证实，益生菌治疗骨质疏松有确切的疗效[11-17]，但其干预骨质疏松的具体机制尚不十分明确，其是通过调节哪些信号分子的表达来发挥作用，以及这些信号分子如何影响成骨细胞和破骨细胞的活性都有待进一步的探索。mTORC1 普遍存在于人体细胞中，控制着许多细胞的生长过程，最近的研究也发现，mTORC1 与骨质疏松关系密切，已成为调节成骨细胞和破骨细胞生长与繁殖的主要效应物，而目前尚未发现mTORC2 有这种功能[9]。因此探索益生菌与mTORC1 的关系成为未来研究的一个主要方向。通过了解益生菌干预骨质疏松的mTORC1 信号通路将有助于人们制订出更有效的治疗策略。

4 益生菌干预骨质疏松的mTORC1 信号通路

4.1 益生菌通过IGF1-PI3K-mTORC1 信号通路调节成骨细胞活性

胰岛素可以促进成骨细胞在细胞和分子水平的增殖和分化，从而促进新骨形成[18]。研究发现，给长期缺乏营养的小鼠喂养植物乳杆菌可以增加血清中的IGF1 水平[11]。IGF1 可作用于成骨细胞表面胰岛素样受体（insulin-like receptor, IR）激活IR 的酪氨酸激酶活性，活化的IR 通过磷酸化胰岛素受体底物1（insulin receptor substrates, IRS1）使磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI-3K）激活，活化的PI-3K 可以催化细胞膜磷脂中的4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate, PIP2）生成三磷酸磷脂酰肌醇，继而招募磷脂酰肌醇依赖性激 酶1（phosphatidylinositol-dependent kinase, PDK1）和一种丝/苏氨酸激酶-蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）形成二聚体，其中PDK1 可以使PKB 磷酸化而激活[19]。活化的PKB 使TSC1/TSC2 发生磷酸化致胞质中Rheb/GTP 聚集，从而激活mTORC1，促进成骨细胞增殖分化[9]。因此，益生菌可以通过上调体内IGF1的表达，激活成骨细胞中mTORC1 信号通路。

4.2 益生菌通过TNF-α/OPG-RANKLmTORC1 信号通路调节破骨细胞活性

破骨细胞来源于骨髓单核/巨噬细胞系造血祖细胞，其异常激活可以导致多种骨骼疾病，包括骨质疏松、骨关节炎及骨肿瘤等。研究发现，多种细胞因子可以促进破骨细胞的分化，其中核因子κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factorκB ligand, RANKL）被证明是破骨细胞分化所必须的细胞因子[20]，其肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）超家族的成员，可作用于核因子κB 受体活化因 子（receptor activator of nuclear factor-κB, RANK），诱导单核/巨噬细胞系造血祖细胞形成破骨细胞[21]。RANKL 主要由成骨细胞和T 细胞分泌，RANK 主要表达于破骨细胞和树突状细胞[22]。研究发现，RANKL会激活破骨细胞中的mTORC1 信号通路，促进破骨细胞分化成熟[23]。其具体机制为：RANKL 与RANK 在破骨细胞上的结合会导致TNF 受体相关因子（tumor necrosis factor receptor-associated factor, TRAF）的募集而活化。TRAF 家族蛋白包括TRAF2、5、6，其中TRAF6 最重要（因为只有TRAF6 缺陷小鼠会出现骨质疏松症），可以激活PKB 和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）[24]，活化的PKB 和MAPK 分别促使TSC1/TSC2 复合物磷酸化，继而引起细胞质中Rheb/GTP 聚集，促进mTORC1 活化，促进破骨细胞增殖分化[25]。研究发现，体内雌激素缺乏会导致RANKL 和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的表达增强，促进骨质疏松的发生[26]。BRITTON 等[12]用罗伊乳杆菌（lactobacillus reuteri, LR）喂养去卵巢（Ovariectomized, OVX）小鼠可以预防OVX 小鼠模型的骨丢失。通过对比LR 喂养的OVX 小鼠和未喂养的OVX 小鼠，发现LR 喂养的OVX 小鼠体内T 细胞和非T 细胞来源的RANKL 显著减少。此外，DAR 等[13]进一步研究发现，用LR 喂养小鼠可以抑制其体内多种炎症细胞因子的表达，包括白细胞介素-1（Interleukin-1, IL-1）、白细胞介素-6（Interleukin-, IL-6）、白细胞介素-7（Interleukin-7,IL-17）、TNF-α。而这些炎症因子被证明可以上调成骨细胞中RANKL 的表达，从而导致破骨细胞分化成熟和骨吸收，其中TNF-α 发挥最主要的作用[27]。OHLSSON 等[14]研究也发现，用益生菌治疗小鼠不仅降低了炎症细胞因子TNF-α 和IL-1 的表达，而且增加了OVX 小鼠皮质骨中骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）的表达。已知OPG 是肿瘤坏死因子受体（tumor necrotic factor receptor, TNFR）超家族成员之一，在许多组织中都有表达，如肺、心脏、肾脏和骨骼，可通过结合RANKL 防止破骨细胞中mTORC1 信号通路的激活，从而发挥骨保护作用[28]。因此，益生菌可通过减少炎症因子（例如TNF-α 和IL-1）的表达和增加OPG 的表达，间接抑制RANKL 对破骨细胞mTORC1的活化，从而到达到干预骨质疏松的目的。

4.3 益生菌通过Wnt-GSK3-mTORC1 信号通路调节成骨细胞活性

在过去的几十年中许多实验证据表明，Wnt 信号对骨小梁和骨皮质的形成都至关重要。已知的Wnt信号通路包括Wnt 配体、单程跨膜脂蛋白受体相关蛋白（lipoprotein receptor-related protein, LRP）、七次跨膜受体卷曲蛋白（Frizled, FZD）。此外，细胞质中还存在一种异源四聚体破坏复合物，组成成分包括轴抑制蛋白、酪蛋白激酶1、腺瘤性息肉病蛋白、糖原合成激酶3（glycogen synthase kinase 3, GSK3）[29]。关于Wnt 信号通路，目前研究最深入的是其经典途径——Wnt/β-连环蛋白信号传导途径，通过抑制转录因子β-连环蛋白的降解，达到促进细胞生长发育的目的。然而最近研究发现，Wnt 配体与FZD 和LRP的结合也能激活mTORC1 信号通路[30]。其具体机制为：当WNT 与LRP 和FZD 结合后，会招募Dishevelled 蛋白结合到FZD 的胞质尾部，导致破坏复合物的分解，从而抑制GSK3 活性，而GSK3 可以通过磷酸化TSC1/TSC2 复合物而抑制mTORC1 的激活，这一作用与Akt磷酸化TSC1/TSC2 复合物激活mTORC1 不同，因此Wnt 可以通过抑制GSK3 活性而激活mTORC1 信号通路，促进成骨细胞增殖分化[31]。Wnt10b 是公认的Wnt信号激活剂，属于Wnt 的一种亚型。其过度表达会使成骨细胞数量增加，从而导致骨小梁过度形成。然而破骨细胞的数量和活性并没改变，这表明Wnt10b 只作用于成骨细胞，增加骨形成[32]。KANG 等[33]研究也表明，Wnt10b 提高小梁骨质量是通过增加成骨细胞的数量而实现的，其对破骨细胞的数量和活性无影响。研究发现，给正常幼鼠补充鼠李糖乳杆菌（lactobacillus rhamnosus GG, LGG）会增加小鼠的小梁骨体积。进一步研究发现，这是由于LGG 可以引起骨髓和肠道中T 细胞数量增加，并导致其分泌的Wnt10b 增加[15]。ZHANG 等[16]的研究也证实，益生菌可以使1 型糖尿病患者体内成骨细胞中Wnt10b 表达增加。这些研究结果都表明益生菌可以上调成骨细胞中Wnt10b 表达，从而间接激活mTORC1 信号通路，促进成骨细胞增殖分化，达到干预骨质疏松的作用。由于Wnt 配体可以通过经典信号通路和mTORC1 两种信号通路促进成骨细胞增殖分化，因此，关于具体是哪一种信号通路占据主导作用目前尚未可知，其具体机制还有待进一步研究。

4.4 益生菌通过BMP-c-Abl-PI3K- mTORC1 信号通路调节成骨细胞活性。

自从骨形态发生蛋白（the bone morphogenetic protein, BMP）在骨骼中被发现以来，BMP 已经被证明能够刺激多种细胞培养系统中的成骨细胞分化。研究表明，BMP 可以激活mTORC1 从而增强成骨细胞分化过程中的蛋白合成能力[34]。虽然BMP2 可以通过诱导Wnt 的分泌来介导BMP2 的成骨功能[35]，但是BMP诱导成骨细胞蛋白的合成却不依赖于这些新分泌的Wnt 因子，提示BMP2 激活mTORC1 的信号通路不同于Wnt 途径[36]。研究发现，BMP2 在成骨细胞中可以激活酪氨酸激酶c-Abl，而用伊马替尼抑制c-Abl 可阻止BMP2 诱导的PKB、eIF4E-BP1 和P70S6K 磷酸化，有效抑制BMP2 诱导的蛋白合成和与蛋白合成代谢相关基因的表达，该结果提示BMP2 通过c-Abl 激活mTORC1 信号通路。进一步研究发现，PKB 的上游信号分子是PI3K，eIF4E-BP1 和P70S6K 的上游信号分子是mTORC1。为进一步证实PI3K 和mTORC1 在介导BMP2 功能中的作用，又使用LY294002（一种PI3K抑制剂）抑制PI3K，发现完全抑制了BMP2 诱导的蛋白合成，也消除了BMP2 诱导的与蛋白合成代谢相关的基因的表达，使用mTORC1 抑制剂Torin1 也达到了相同的效果。因此，根据以上结果可以得出结论：BMP2 通过c-Abl 激活PI3K/PKB/mTORC1 信号通路，增加成骨细胞中蛋白合成，促进成骨细胞增殖分化[35]。研究发现，用益生菌（长双歧杆菌）喂养OVX 大鼠，可以减少OVX 大鼠的骨吸收并且增加骨形成，增强OVX 大鼠的骨密度。进一步深入研究发现，该作用通过上调BMP-2基因实现[17]。因此，益生菌可以通过上调BMP-2基因的表达间接激活mTORC1 信号通路，促进成骨细胞增殖，干预骨质疏松。

5 总结与展望

骨质疏松症可以引起各种骨骼的严重并发症，对人们的生活质量有着深远的影响。有必要制订新的、安全、有效的策略来预防或治疗由不同条件和变量（包括年龄、生物学性别、疾病、遗传背景）引起的骨质疏松症。近年来发表了多项关于益生菌干预骨质疏松的研究，表明口服益生菌可安全有效地预防各种情况下的骨质流失，显示了益生菌对骨骼健康的潜在益处。然而，益生菌干预骨质疏松的机制十分复杂，目前尚未完全阐明，其可能的机制是通过调节IGF1、炎症因子、Wnt 和BMP 的表达水平间接影响成骨细胞和破骨细胞的mTORC1 活性，但更具体的机制仍需进一步的实验研究去阐明。相信未来通过研究益生菌干预骨质疏松的相关信号通路可以制订出更加有效的治疗策略。