内毒素的生物学特性及其对非洲猪瘟流行下猪只复养的影响

2020-01-13

猪业科学 2020年4期

（1.江西省农业科学院畜牧兽医研究所，江西南昌 330200；2.江西中成人药业有限公司，江西进贤 331700）

在非洲猪瘟（African swine fever, ASF）流行的严峻形势下，要成功复养，除做好非洲猪瘟生物防控措施外，其中重要的一点就是搞好猪场内毒素（Endotoxin, ET）的净化工作。早在百余年前，人们就认识到革兰氏阴性菌（Gram-negative bacteria, GNB）所释放出的一种物质能致动物发热、休克，著名科学家理查德菲佛（Richard Pfeiffe）首次将此物质冠名为“内毒素”。后来的研究证明，这种物质的化学本质就是脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS），故 ET 又叫 LPS[1]。目前，有关ET的生物活性，在人上研究较多且较深入。有关报道多是ET进入人体血液所致的内毒素血症（Endotoxemia,ETM），以及继发的其他疾病。而ET对畜禽的影响，尤其是对猪只健康的影响的报道较少。

1 内毒素（ET）的生物学特性

1.1 内毒素是由革兰氏阴性菌产生并存在于菌体内的一种毒素

ET是一种由GNB产生并存在于菌体内的潜在毒素[1]，其化学本质乃GNB细胞壁中的LPS。这种毒素的潜在毒性，在正常状态下，ET作为构成GNB细胞壁的组分，不会释放出来[1]。只有当GNB死亡自溶，或人工破坏（如用超声波处理）GNB菌体，或将GNB黏附到其他细胞上时，ET的主要活性（毒性）组分LPS就会随细菌外膜小泡囊（Outer membrance vesicles,OMVs）释放出来，对动物机体表现出毒性[2-3]。实验室常用超声波处理GNB或反复冻融GNB的方法来制备试验所需的ET。ET的化学组成复杂，它是一种由“磷脂多糖蛋白质”组成并具有化学异源性的复合物。不同来源的ET其相对分子质量变化范围大，从几千到几万（道尔顿）。ET具有亲脂与亲水的双亲性，能够在水中形成缔合物[4]。因而，进一步加剧了其相对分子质量的变化范围。

1.2 内毒素随细菌外膜囊泡释放

OMVs是一种由细菌细胞外膜形成，普遍存在于GNB以及某些革兰氏阳性菌中，且包含有多种生物学活性物质，外形多为球形，直径约为20～250 nm的囊泡状结构[5]。OMVs由LPS、外膜蛋白、磷脂、DNA及其形成过程中为外膜所包裹的周质成分（Periplasm）等组成，ET随外膜小泡囊而释放[6]。

1.3 内毒素刺激 Toll样受体 4（TLR4）导致炎症因子（IF）的释放

1.3.1 Toll样受体的发现与免疫学意义

1.3.1.1 Toll样受体的发现

Toll基因是一个决定果蝇背腹侧分化的基因，于1980年由Nusslein-Volhard等发现并命名。Toll基因能够编码一种被称为Toll蛋白的跨膜蛋白质（Hashimoto等，1988），其结构与白细胞介素1受体（Interleukin-1 receptor, IL-1R）具有同源性，二者的细胞质部分相似（Gay等，1991）。由于IL-1R是一种存在于哺乳动物中具有天然免疫功能的物质，不由得使人联想到，Toll蛋白或许与免疫有关[5-6]。

1.3.1.2 Toll样受体的免疫学意义

据报道，人体中确实存在着Toll样受体（Nomura等，1994）。1996年，Jules A. Hoffmann等首次发现Toll蛋白具有免疫作用。随着对Toll蛋白免疫功能研究的深入，Toll蛋白新的免疫功能相继被发现；1997年，Charles Janeway等发现有一种后来被命名为Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）的 Toll样受体，具有激活与适应性免疫相关的基因的功能。TLR4能够探测到机体内是否存在着LPS，而且当TLR4因突变而丧失其功能时，试验小鼠不会对LPS刺激有任何反应（Beutle等，1997）[5-6]。后来的研究者们，利用基因打靶的方式，使小鼠的其他各种TLR蛋白功能丧失的研究中发现，每种TLR蛋白可识别不同类的分子。自此，人们不仅完全揭示了Toll样受体在免疫学上的意义，而且找到了百余年前就开始探寻的那个受体物质[5-6]。

1.3.2 内毒素激活炎症因子，引起细胞损伤、死亡

ET的生物学活性极强，作为ET主要活性（毒性）组分的LPS是最早确认的经典致病因子（Pathogenic factor, PF）。是迄今为止研究最深入的病原体相关模式分子（Pathogen-associated pattern molecular, PAPM）。LPS稳定、耐热，其毒性比外毒素低，在动物机体内部发生作用时没有组织器官的特异性，不同病原菌产生的ET引起的疾病症状基本相同，主要表现在：1）发热，造成机体体温升高；2）腹泻；3）粒细胞减少；4）出血性休克；5）败血症；6）弥散性血管内凝血；7）若GNB感染或经静脉注射提取的ET，会出现如呼吸窘迫综合征、急性肾衰竭，甚至多器官功能衰竭等严重疾病，最终因ET而导致休克死亡[2]。把ET注射到机体内虽可产生一定数量的抗体（特异免疫产物），但这种抗体的作用很弱，不能抵消ET毒性作用。

1.3.3 内毒素激活炎症因子的信号转导机制

ET激活炎症因子（Inflammatory factor, IF）的信号转导机制为：ET进入机体内，第一，与血液中的内毒素结合蛋白（Endotoxin binding protein, EBP）结合形成ET-EBP复合物；第二，复合物再与单核巨噬细胞（Mononuclear macrophages）这类髓源性细胞（Myeloid cells）表面的LPS受体CD14（Membrane receptor CD14, mCD14）或血液中的可溶性受体CD14（Soluble receptor CD14, sCD14）结合；第三，在髓样分化蛋白-2（Myeloid differentiation protein-2, MD-2）的参与下，激活TLR4信号通路；第四，ET刺激信号沿着激活的TLR4信号通路传向细胞内，再通过髓样分化因子88（Myeloid differentiation factor 88, MyD88）依赖与非依赖这样两条途径，启动一系列信号级联反应（Signal cascade reaction, SCR），诱导促炎细胞因子（Proin flammatory cytokine, PIC）的表达，刺激单核细胞、巨噬细胞等合成并释放IL-1β, IFNγ与TNF-α等高生物活性IF，引发炎症（红肿、发热、疼痛与出血）以及细胞损伤、组织死亡与动物休克。Toll样受体家族中的TLR4是ET的主要受体。ET在刺激TLR4导致一系列IF释放的同时，有效地激活了机体的免疫应答。ET/TLR4信号传导在这一过程中起着极其重要的作用，是炎症反应及其控制的关键点，已成为治疗ETM的研究热点。

2 非洲猪瘟流行下猪场环境中内毒素对猪只的影响

2.1 猪场环境中内毒素对猪只呼吸系统的影响

猪场环境中尤其是空气中不可避免地存在着ET，这是由猪场空气中不可避免地存在着的尘埃所决定的。猪场空气中ET含量的多少取决于空气中尘埃的含量及其组成（如粪尿、皮屑、饲料、垫草、微生物及其细胞壁组分等）。猪场空气中ET浓度的高低关系到猪只的健康，尤其是猪呼吸系统的健康。据报道，猪场空气中ET含量与猪肺炎、胸膜炎的发病率以及新生仔猪的死亡率具有一定的相关性[7]。另据报道，猪场空气中的ET可诱发猪的中毒性肺炎[8]。也有研究表明，猪舍空气中的ET与尘埃会造成猪呼吸道功能紊乱，并损伤猪的鼻黏膜[9]。在当前ASF仍在流行的大环境下，猪场空气中的ET更是增加了猪只对ASF以及猪只其他疾病尤其是呼吸道疾病的易感性。所以，在猪场实施严格的生物安全措施时，还要注意清除猪场空气中的尘埃，尽最大可能减少空气中的尘埃，从而尽可能地降低空气中的ET存在。

2.2 猪场环境中内毒素对猪只生产性能的影响

猪场环境中无处不存在着ET，这是由猪场中无处不在的GNB等微生物所决定的。ET进入猪体后，会刺激猪体产生一系列免疫应答反应，从而降低猪只的生产性能，并最终影响到猪场的经济效益。免疫应答是造成猪只生产性能下降的原因，主要在两个方面：一是ET进入猪只体内引起的免疫应答反应，会导致猪体发热（消耗能量），PIF增多（消耗蛋白），并减少猪只的采食量，猪只最终会因“入少出多”而降低生产性能[10]；二是ET引起的免疫级联反应（Immunologic cascade, IC），会改变猪只体内的代谢而引起营养物质的重新分配，导致一些用于生长的营养物质重新分配到免疫系统，进而降低猪只的日增重与饲料转化率[11]。据报道，受ET入侵的猪只，其胰岛素样生长因子－ 1（Insulin-like growth factor-1,IGF-1）、前列腺素E2（Prostaglandin E2）、皮质醇（Cortisol）、白细胞介素 (IL)－ 1β（Interleukin-1β, IL-1β）的含量远高于对照组的相应指标值[10]。而日采食量与日增重则较对照组分别下降了12.8%与13%[10]。给断奶仔猪按体重200 ug/kg剂量肌注ET，研究发现：1）饲料利用效率方面，肌注ET的试验组猪只的日采食量、日增重、饲料转化效率分别较对照组猪只的相应值降低28%、43%与21%[12]；2）氮平衡试验方面，肌注ET的试验组猪只的氮摄入量、氮沉积率与氮表观消化率分别较对照组猪只的相应值降低27%、45%与9%[12]。这是因为感染ET的猪只，其骨骼肌蛋白质分解率显著增加，以满足合成急性期蛋白（Acute phase protein, APP）对氨基酸（Amino acid, AA）的需要[13]。此外，ET诱导产生的IL-1、IL-6与TNF-α等炎症细胞因子，一方面通过降低IGF-1、生长激素（Growth hormone, GH）等合成代谢激素的释放以减少蛋白质合成所需的AA，从而将“节流”来的AA用于合成APP；另一方面通过增加糖皮质激素（Glucocorticoid, GC）等分解代谢激素的释放以增加蛋白质的分解[14]，从而将“开源”来的AA用于合成APP。

2.3 猪场环境中内毒素对猪只肾脏钠钾ATP酶（Na-K-ATPase）的影响

猪场环境中的ET导致猪只感染，感染猪只引发的体内系统性免疫应答，导致干扰素-γ（Interferon-γ, IFNG）、TNF-α、IL-1与IL-6等体内促炎性细胞因子（Proin flammatory cytokine,PIC）的表达量显著增加[15]。在这些PIC的刺激下，肾脏上皮细胞可激活存在于肾脏近曲小管上皮细胞中的一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase, iNOS）[16]的表达，进而产生一氧化氮（Nitric oxide, NO）[17]。所生成的内源性NO因具有扩张血管的作用，从而导致肾血压与肾小球的滤过率降低[18]。NO与过氧化物反应生成的过氧亚硝酸根离子（ONOO－）[19]是一种强氧化物，可以氧化肾脏近端小管中的钠钾ATP酶（Sodiumpotassium ATPase, Na-K-ATPase）活性中心的巯基，从而抑制其活性[20]。此外，所生成的内源性NO对肾脏中Na-K-ATPase的活性亦具有直接的抑制作用，并造成肾脏近曲小管的氧化损伤，进而降低近曲小管的重吸收能力[21]。