外泌体在白血病发生发展及治疗中的作用①

龙丽娟 李 卫

(广西医科大学第一附属医院儿科，广西 530021)

白血病是一类起源于造血器官的克隆性恶性疾病。根据FAB分型标准，将白血病分为：急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、慢性粒细胞白血病(chronic granulocytic leukemia，CML)四类。据统计，2014年白血病在我国男性和女性中发病率分别为5.69/10万、4.40/10万，在0～35岁男性和女性恶性肿瘤发病率和死亡率中占据首位[1]。目前的治疗方法除了传统的化疗、放疗、造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)外，还出现针对白细胞不同靶点的多肽、抗体、小分子药物的靶向治疗。随着治疗方法的发展，完全缓解(complete remission，CR)率得到提高，联合化疗后AML的CR率可达50%～80%，ALL可获得90% CR率。达CR的患者，AML有50%～80%的复发率，ALL亦有很高的复发率。近期研究发现，外泌体在白血病的发生发展和耐药等过程中发挥重要的作用，同时也可为免疫治疗方案改进提供新思路。

1 外泌体的发生发现

20世纪80年代，外泌体首次发展于网织红细胞中，1987年Johnstone等[2]将其命名为“exosomes”。外泌体是大小为30～150 nm的脂质双层膜封闭的囊泡。在外泌体形成的过程中，细胞膜内陷，形成内体，在转运所需的内体分选复合体(the endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)、液泡蛋白分选因子4 ( vacuolar protein sorting 4,Vps4 )、凋亡相关基因-2受体蛋白 X(ALG-2-interacting protein X，ALIX)、人肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101，TSG101)等的参与下，将带有泛素化的“货物(cargo)”分选入内陷空泡发育成多囊泡体，然后经Rab蛋白、膜联蛋白(annexins)、脂阀结构蛋白(flotillin)作用，内体膜与质膜融合，通过胞吐作用释放外泌体。外泌体可由多种细胞分泌，并分布在各种体液中，包括血液、尿液、唾液、母乳、脑脊液等[3]，其携带亲本细胞蛋白质、代谢物、RNAs (mRNA、miRNA、lncRNA)、DNAs (mtDNA、ssDNA、dsDNA)和脂质等在细胞间通讯中发挥着重要作用。外泌体介导的细胞间通讯不仅参与正常生理过程的调节，也参与包括癌症在内的许多疾病的病理过程[4]。

2 外泌体在白血病发生发展过程中的作用

2.1白血病细胞通过外泌体重编程BM微环境 骨髓(bone marrow，BM)微环境是造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)赖以生存的基础，与造血调控紧密相关,而肿瘤细胞来源的外泌体可通过传递其携带的内容物重编程BM微环境[5]。研究发现，原发性AML和AML细胞系均释放显著高于正常对照细胞的外泌体。这些外泌体富集了与AML发病相关的几种RNA，包括GATA1、FOXP3、SHIP1、ID1、E2F1、CEBP-a、CEBP-b、Myc和MEF2C，它们可被骨髓基质细胞摄取从而改变骨髓基质细胞生长因子的分泌[6]。El-Saghir等[7]通过将骨髓基质干细胞(bone marrow stroma stem cells，BMSCs)与HuT-102(人T淋巴瘤细胞系)共培养，发现HuT-102衍生的外泌体能够将Tax mRNA转移至受体MSC，进一步诱导NF-κB活化，导致它们丧失其干细胞特性，转成可能支持白血病进展的促迁移和血管生成的表型。

Kumar等[8]从 AML细胞培养物的上清液提取外泌体，与B6小鼠新鲜分离的BM共孵育，流式细胞术检测外泌体主要被BM基质和内皮细胞内化。骨髓Sca1+和CD146+基质细胞显著增加，CD166+细胞显著减少；调节正常造血功能的基因(IGF1、CXCL12、KITL和IL-7)或与骨发育有关的基因(IGF-1、OCN和Col1A1)下调，而正常造血和成骨细胞发育的抑制因子(DKK1)上调。结果表明白血病发病过程中，AML细胞逐渐占据并可能改变正常的BM微环境，将正常的造血生态位转变为“白血病生态位”，使白血病细胞生长变得容许，而破坏正常的造血功能。

Corrado等[9]发现，用LAMA84 CML细胞释放外泌体处理HS5 BM基质细胞，可使其IL-8表达增加。IL-8作为一种激活趋化因子，其激活两种受体(CXCR1和CXCR2)下游的多种信号传导途径，促进CML细胞的黏附和迁移。

2.2白血病外泌体直接靶向HSC 正常造血需要BM微环境及HSC之间复杂的双向相互作用。Hornick等[10]发现从培养的AML细胞分离的外泌体和移植AML细胞的小鼠的血浆均富集miR-150和miR-155。以AML衍生的外泌体处理HSC，导致c-MYB在HSC中表达下降。而c-Myb-/-鼠表现出与AML衍生的外泌体处理的HSPC中观察到的相似的造血损伤。鉴于c-MYB基因产物是造血所需的高度保守的转录因子，考虑白血病外泌体通过将miRNA平行转移至HSC，靶向c-MYB而破坏正常造血功能。

2.3白血病外泌体对免疫功能的调节作用 肿瘤细胞来源的外泌体(tumor cell derived exosomes，TEX)对免疫细胞的作用是双向的，可对免疫细胞发挥抑制或刺激作用。然而，肿瘤微环境中TEX与免疫细胞相互作用的总体效果是免疫抑制[11]。TEX含有可通过不同机制诱导免疫细胞功能障碍的分子，包括核酸、蛋白和细胞因子，向免疫细胞传递致耐受性信号。

白血病细胞来源的外泌体(leukemia cell derived exosomes，LEX)通过干扰NK细胞的活化来影响免疫功能。NK细胞是固有免疫的主要参与者之一，在免疫监视中起重要作用。Szczepanski等[12]通过检测19个AML患者及14个健康对照的血清外泌体，发现AML患者血清中外泌体含量高于对照组，除了传统的外泌体标记,它们含有TGF-β1、MICA/MICB和髓系母细胞标记、CD34、CD33和CD117。这些外泌体下调NKG2D表达，干扰NK细胞活化，导致其杀伤肿瘤细胞毒性下降。NK细胞细胞毒性还与BAG6有关，BAG6呈递在外泌体表面上时，NK细胞被激活。血浆游离BAG6则下调NK细胞上的表面受体CD16和CD56，起抑制NK细胞的细胞毒性作用。Reiners等[13]发现在晚期疾病阶段中，可溶性BAG6具有最高水平，抑制NK细胞的抗肿瘤免疫。

LEX诱导活化的CD8+T细胞凋亡。TEX携带来自亲本细胞的加载了肿瘤抗原肽的MHC-Ⅰ分子，能够激活CD4+T细胞，分泌细胞因子，辅助CD8+细胞活化，协助NK细胞清除和杀灭肿瘤，也可以通过转移免疫抑制因子、传递免疫耐受信号，调节淋巴细胞的增殖分化介导免疫逃逸。研究显示，AML患者的血清中外泌体浓度高于健康对照，与活化的CD8+T细胞共培养，可下调CD3-zeta、JAK3表达，导致激活信号转导不足。LEX还通过其携带的FasL，与CD8+细胞表面Fas(CD94)结合，激活内源性Fas/FasL途径，导致T细胞凋亡。此外，TEXs携带 TGF-β和IL-10，促进Treg增殖，而Treg完全抵抗TEX介导的细胞凋亡[14]。

LEX协助将肿瘤患者单核细胞重编程为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)，即免疫抑制表型。这导致单核细胞募集到肿瘤组织中，在那里它们支持肿瘤起始，促进局部进展和远处转移。Haderk等[15]发现，CLL衍生的外泌体将hY4转移至单核细胞，将单核细胞转化为TAM，其分泌细胞因子如CCL2、CCL4、IL-6、PD-L1，导致免疫逃逸。

树突状细胞(dendritic cells，DCs) 具有调节免疫应答以及诱导免疫耐受的能力。而DCs发挥免疫刺激亦或是免疫抑制的功能在很大程度上与其是否成熟有关。成熟的DCs可介导抗肿瘤免疫，而未成熟的树突状细胞可致免疫耐受。LEX对于DCs功能影响的研究，主要在免疫刺激方面作用。Shen等[16]发现NB4细胞系衍生的外泌体表达蛋白质视黄酸受体α和间质细胞黏附分子1，并含有热休克蛋白70。细胞毒性测定提示，用外泌体脉冲的DCs诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)在杀灭靶NB4细胞方面优于单独用DCs诱导的CTL。

3 白血病细胞外泌体对白血病治疗预后的影响

获得性肿瘤细胞化疗抗性是治疗血液恶性肿瘤的主要障碍。近年来，随着免疫治疗的发展，在各种已知的耐药机制中，TEX因其在肿瘤细胞之间水平转移药物抗性的能力而受到特别关注。凋亡调节蛋白(BCL-2、MCL-1、BCL-X和BAX)在AML细胞中的表达与无病存活相关[17]。实验证明，抗凋亡的AML细胞影响其邻近治疗敏感细胞中凋亡相关蛋白的表达。表现为凋亡敏感细胞的抗凋亡蛋白谱上调，如细胞因子诱导的细胞凋亡抑制因子1(CIAPIN1)，STAM结合蛋白(STAMBP)和HMGB1，而这些负调节因子保护白血病细胞免受药物诱导的死亡。Galectin-3与恶性肿瘤的不良预后有关。原发性人前B细胞 ALL中，MSC表达Galectin-3升高，并由通过外泌体将其传递至ALL细胞，支持肿瘤细胞存活，通过参与耐药形成而影响白血病治疗效果[18]。

LEX干扰过继免疫细胞疗法。Hong等[19]发现从接受NK-92细胞治疗前的AML患者血浆中分离出来的外泌体，通过向受体细胞递送免疫抑制性内容物，如TGF-β1/LAP、CD39/CD73胞外酶、PD1/PD-L1或Fas/FasL，阻断了NK-92细胞的抗白血病细胞毒性。

LEX在白血病的复发中也起到一定作用。目前急性白血病联合化疗、HCST等治疗后无病生存率可达25%～40%，约有一半以上患者存在治疗缓解后复发。白血病的复发主要来源于体内残留白血病细胞，残留白血病细胞诱导的正常造血移植物的恶性转化被认为是供体细胞白血病(donor cell leukemia，DCL)的关键机制。Zhu等[20]提取源自K562细胞(人类慢性粒细胞白血病急变细胞系)的含有BCR-ABL1 mRNA的微泡并用其处理单核细胞。在与BCR-ABL1阳性微泡孵育后，源自正常移植的单核细胞在体外和体内均表现出白血病样恶性表型。

4 外泌体在白血病治疗和监测中的作用

4.1监测白血病复发、耐药的生物标志物 经过诱导缓解治疗达CR后(包括骨髓移植治疗后)患者体内仍会残留109以下白血病细胞,这些细胞用常规显微镜是检测不到的,而多参数流式细胞术(MPFC)监测微小残留病(MRD)依赖于肿瘤细胞异常的免疫表型，包括交叉抗原表达、抗原表达不同步、抗原表达水平的升高或降低，且治疗中可能存在免疫表型的变化，因而在实际应用中存在一定局限性。聚合酶联反应也因白血病治疗过程中克隆演变，确定重排点耗时而使用受限。外泌体携带来自亲本细胞的核酸、蛋白、脂质、代谢物等，代表了亲本细胞的生物学行为。与正常细胞衍生的外泌体相比，AML衍生的外泌体含有不同的蛋白质谱，如TGF-β1，MICA/MICB和骨髓原始标记物，CD34和CD117 ，耐药AML来源外泌体高度富集Bcl-2家族成员，监测患者外泌体变化情况可反应白血病复发与耐药状态[21]。

4.2免疫治疗 化疗和HSCT后微小残留白血病细胞(minimal residual leukemia cells，MRLs)是白血病复发的主要原因。免疫疗法可作为消除化疗和移植后MRLs的方法，以减少和预防白血病复发。TEX携带亲本细胞肿瘤抗原，而DC作为最强的抗原递呈细胞，可摄取、加工、递呈抗原，激活Th、Tc、NK细胞，触发和调节免疫应答。Yao 等[22]发现K562白血病细胞衍生的外泌体携带细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和免疫相关分子(HSP70)，LEXs脉冲的DC比LEXs和非脉冲DCs更有效地诱导抗白血病细胞毒性T淋巴细胞免疫应答。因TGF-β1存在，TEX免疫原性降低，Huang等[23]的试验表明，沉默TGF-β1的白血病细胞外泌体，较之于未沉默TGF-β1外泌体，有更好的诱导肿瘤特异性免疫的潜能。

4.3药物载体 肿瘤基因治疗需要向肿瘤细胞递送DNA、RNA或类寡核苷酸分子等，而这些物质在体内很容易被核酸酶破坏或降解，因而需要研发更高效安全的基因递送载体。外泌体由脂质双分子层膜包裹，可保护核酸、蛋白因子免受破坏降解，并递送至靶细胞[24]。TEX还可携带化疗药物，更高效的靶向肿瘤细胞。与正常造血细胞相比，IL3-R在CML细胞中过表达，能够在抗癌药物递送中充当受体靶标。Bellavia等[25]用HEK293T细胞来表达与IL-3片段融合的外泌体蛋白Lamp2b，荷载伊马替尼的IL3-Lamp2b外泌体能够靶向CML细胞并抑制体外和体内癌细胞生长。

外泌体自发现至今，因其众多的生物学功能及作为新兴的肿瘤标记物引起了广泛的兴趣。其独特的分子和遗传特征，改变各种正常和恶性受体细胞功能的能力表明外泌体在健康和疾病中起着重要的调节作用。在白血病中，LEX似乎涉及恶性转化的所有方面，如促进肿瘤细胞的存活和抗性，抑制抗肿瘤免疫。LEX作为肿瘤标记物提示治疗的反应的潜力和LEX在免疫疗法中的作用得到更深的探究。进一步关于LEX的研究，将致力于白血病细胞如何通过LEX促进自身生长和进展的机制的探索，以及如何改进其在免疫治疗中的作用。