Keap1/Nrf2/p62和NLRP3炎性小体与自噬调节作用的研究进展

杨根梦，洪仕君，王一航，沈宝玉，于 浩，曾晓锋，李利华

(昆明医科大学法医学院， 昆明 650500)

细胞自噬 (autophagy)分为3种不同的形式：小自噬 (microautophagy)、分子伴侣介导的自噬 (chaperone-mediated autophagy)和大自噬 (macroautophagy)。通常所说的自噬是指大自噬,其发生过程可分为4个阶段：分隔膜的形成；自噬体的形成；自噬体的运输、融合；自噬体的降解。自噬由自噬相关基因(autophagy related gene,Atg)进行调控，截至目前为止，可作为自噬标志物的基因有LC3、Beclin1、Atg5及Atg7等[1-3]。细胞自噬参与机体多种疾病如肿瘤，炎症，神经退行性疾病和心血管疾病等的调节。但自噬的调控机制非常复杂，至今尚未完全阐明。

核因子NF-E2相关因子 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是机体抗氧化应答反应的核心途径之一，Nrf2的缺失或激活障碍，会加重机体氧化应激状态、破坏细胞内正常的氧化还原平衡的稳态，导致细胞功能障碍，引起细胞毒性，甚至死亡。在正常生理状态下，Nrf2的激活依赖于Keap1，Nrf2和Keap1 在细胞质内形成复合体处于抑制状态，并通过Keap1介导的泛素化对Nrf2 持续进行降解以维持转录形成的Nrf2 之间的平衡[4]。p62，也称SQSTM-1，是一种多面衔接蛋白，其主要功能是将泛素化的蛋白质带到蛋白酶体中进行降解，p62对Keap1具有调节作用。研究表明，Keap1/Nrf2/p62可参与中毒、肿瘤、凋亡和自噬等的调节[5-7]。NLRP3炎性小体是一种多聚体蛋白复合物，由NLRP3，ASC和pro-caspase-1组成。NLRP3炎性小体作为一种重要的促炎性细胞内受体，在炎症反应中发挥重要作用。研究表明，NLRP3炎性小体可参与自噬的调节[8]。因此，本文主要从Keap1/Nrf2/p62和NLRP3炎性小体与自噬的调节方面进行综述。

1 细胞自噬的双重作用

在生理情况下，自噬主要是一种应激适应机制，促进细胞的生存。但过度应激时，细胞自噬可看成是一种特殊形式的死亡。近年来，尤其是用Atg基因敲除研究，证实了细胞自噬与细胞死亡之间的相互关系。但到目前为止还不能断定究竟是何种因素决定细胞自噬过程是保护作用还是毒性作用。细胞自噬与细胞生死之间具有复杂的关系，这种复杂性反映了细胞自噬在疾病调节中具有复杂多变的作用。激活自噬可作为抗氧化途径，通过清除受损或功能失调的蛋白质和细胞器，对神经退行性疾病和癌症等具有保护作用[9-10]。在毒品滥用机制研究中发现，抑制自噬可使大鼠多巴胺能细胞通过激活caspase-3促进甲基苯丙胺诱导的细胞凋亡，说明自噬对甲基苯丙胺诱导的神经毒性作用具有保护作用[11]。然而，有研究表明，甲基苯丙胺诱导自噬对神经细胞具有明显的毒性作用[12-13]。说明自噬对机体的调节是一把“双刃剑”，自噬一旦激活，必须在渡过危机后适时停止，否则自噬过度激活将导致细胞发生不可逆的损伤。

2 Keap1/Nrf2/p62的结构及相互调节作用

Keap1是Cul3-泛素E3连接酶复合物的衔接子,由 624个氨基酸组成，包括5个区，即NTR、BTB/POZ、IVR、DGR/Kelch 和CTR。Nrf2是机体较为重要的抗氧化防御体系，其发挥作用需要与抗氧化反应元件(ARE)相结合，调控下游抗氧化酶和II相解毒酶基因的转录活性，增强细胞清除活性氧自由基的能力，从而降低氧化应激对细胞、组织及器官造成的损伤[14]。Keap1对Nrf2具有负调控作用，正常情况下Keap1/Nrf2形成复合物定位于细胞质中，Nrf2被Keap1-Cul3-E3泛素连接酶复合物泛素化并被26S蛋白酶降解以维持其稳态水平，而处于抑制状态。在应激条件下，Keap1中的半胱氨酸残基可发生修饰而使Keap1构象发生改变，从而使Nrf2从Keap1/Nrf2复合物中分离出来，同时半胱氨酸残基可抑制E3泛素连接酶的活性，使Nrf2不能泛素化和降解，最终激活Nrf2，激活的Nrf2从胞质进入核内，与小Maf蛋白形成二聚体，该二聚体可与ARE结合，激活抗氧化基因和蛋白的表达，从而发挥抗氧化应激和细胞保护的作用[5,15-16]。p62主要功能是将泛素化的蛋白质带到蛋白酶体中进行降解，此外，p62可通过LC3相互作用区与自噬标志性蛋白LC3直接相互作用。因此，p62被认为是泛素化蛋白和自噬之间的联系[16]，同时，p62已广泛作为自噬流的标志。Keap1/Nrf2是抗氧化应激的关键调控因子。p62也可调节Nrf2的活性，p62结构中含有STGE序列可与Keap1中kelch结构域相结合，从而破坏Keap1/Nrf2复合物的稳定性，使Nrf2从复合物中解离出来而激活Nrf2。由于p62可与LC3相互作用，因此Keap1/Nrf2/p62与自噬的调节具有相互作用。若p62异位表达或自噬缺陷，使p62与Keap1结合形成聚集体，使Nrf2泛素化和降解减少，而激活Nrf2，该过程称为Nrf2激活的非经典机制[5-7]。

3 NLRP3炎性小体的结构

Nod样受体(nod-like receptor，NLRs)是一种细胞质识别受体，主要负责IL-1β和IL-18的加工和释放。截至目前为止，在人类中已发现22个NLR成员，小鼠中有34个，而根据它们N末端区域的不同分为NLRA，NLRB，NLRC和NLRP四个亚家族。其中NLRP3是研究最多且研究较为透彻的亚基[17-18]。NLRP3炎性小体作为一种重要的促炎性细胞内受体，在应激状态下，NLRP3将募集ASC蛋白并作为激活pro-caspase-1的支架，无活性的pro-caspase-1将寡聚化并自动水解切割形成具有活性形式的caspase-1，激活的caspase-1直接诱导IL-1β和IL-18前体的加工，促进IL-1β和IL-18的成熟和释放[19-20]。研究表明，氧化应激释放的ROS可激活NF-κB，NF-κB又激活NLRP3炎症小体，促进IL-1β和IL-18分泌增多，IL-1β是一种正反馈式促炎因子，可放大炎症反应。由于NLRP3炎症小体的激活可释放大量IL-1β，IL-18和其他炎性因子，从而激活程序性的炎症坏死，此过程称为细胞焦亡(pyroptosis)[15，21]。然而，在应激状态下，针对NLRP3炎症小体的激活对细胞命运走向的影响，目前仍然是一个没有明确且存在众多争论的论题。

4 Keap1/Nrf2/p62和NLRP3炎性小体与自噬的关系

4.1 Keap1/Nrf2/p62与自噬的调控作用

大量研究证实，Nrf2通过Nrf2-Keap1-p62反馈环参与氧化应激诱导自噬的调节[22-23]。Tang等人[6]对椎间盘退化研究中发现，在衰老过程中，缺乏Nrf2可加重椎间盘的退化，同时自噬相关基因 (LC3,p62,Atg5,Atg7)的表达减少。并且椎间盘退化过程中髓核细胞发生明显氧化应激，同时自噬水平明显上调，而缺乏自噬的细胞发生氧化应激毒性作用较为明显，说明自噬可通过Keap1/Nrf2/p62通路被激活而发挥抗氧化作用。此外，氧化应激状态下，听觉细胞的死亡取决于自噬与ATP耗尽所致坏死之间的平衡，而自噬通过p62与Keap1/Nrf2相互作用而对氧化应激诱导细胞坏死发挥保护作用[23]。总之，自噬依靠p62与Keap1-Nrf2-ARE信号通路相互作用[24]，p62的磷酸化在选择性自噬期间可激活Keap1-Nrf2通路而发挥相应的作用[7]。当机体发生氧化应激时可激活自噬和p62介导的Keap1-Nrf2系统。自噬和Keap1/Nrf2/p62系统之间相互作用，对控制氧化还原稳态和保护细胞完成适应性应激反应至关重要[25]。

4.2 NLRP3炎性小体与自噬的调控作用

研究表明，通过自噬可诱导NLRP3炎性小体的激活，NLRP3发生磷酸化后可减少NLRP3炎性小体的激活从而减少IL-1β和IL-18的分泌[26]。大量ROS可激活NLRP3炎性小体而破坏肠屏障功能，同时NLRP3炎性小体的激活可诱导自噬，NLRP3炎症小体的激活和自噬对肠屏障功能的破坏具有相互协同作用[27]。急性肾损伤时，线粒体可释放大量ROS并激活NLRP3炎性小体，同时可激活自噬，该选择性自噬可通过PINK1-parkin途径降解受损的线粒体和减少ROS的释放来抑制NLRP3炎性小体的激活，从而对肾具有保护作用[28]。此外，锰可使小鼠海马和BV2细胞自噬功能障碍而激活NLRP3炎性小体，使大量促炎因子IL-1β和IL-18在体内聚集引起神经炎症反应而损害海马神经细胞，从而导致海马依赖的学习和记忆障碍，这可能与阿尔茨海默病的发病机制有关[29]。总之，NLRP3炎性小体和自噬之间具有密切联系。NLRP3炎性小体可激活自噬，自噬也可激活NLRP3炎性小体，两者之间的调节具有双重[8]和双向作用[8，30]。

4.3 Keap1/Nrf2/p62和NLRP3炎性小体与自噬之间的相互作用

Nrf2系统和NLRP3炎性小体之间可相互作用，Nrf2系统可调节NLRP3炎性小体下游基因的表达，而NLRP3炎性小体的激活又可调节Nrf2系统，两者的相互作用与许多急性和慢性炎症，氧化应激以及自噬有关[31-32]。急性肾损伤过程中，机体Nrf2/ARE/HO-1通路的抗氧化防御体系明显减弱，大量ROS聚集可激活NLRP3炎性小体，从而使肾损伤[15]和肾毒性[33]更加明显。而脑缺血再灌注损伤后，机体可激活Nrf2/ARE信号通路来抑制ROS诱导NLRP3炎性小体的激活，从而对脑损伤具有保护作用[34]。上述研究说明机体存在危险信号时，Nrf2系统与NLRP3炎性小体之间可相互调节。然而Nrf2体系和NLRP3炎症小体对自噬的调节存在复杂的关系，激活Nrf2诱导的自噬可激活NLRP3炎症小体，但在某些情况下，自噬的激活可抑制NLRP3炎症小体的活化，同时也说明自噬对机体的调控具有双重作用。研究表明，自噬激动剂雷帕霉素可通过p62/SQSTM1依赖的方式激活自噬，通过自噬清除线粒体ROS和pro-IL1β，从而减少IL-1β和IL-18的产生。同时雷帕霉素上调p62/SQSTM1激活Nrf2通路，更进一步清除mtROS，使IL-1β明显减少[35]。此外，Nrf2激动剂萝卜硫素可激活Nrf2通路而抑制NLRP3炎症小体，从而对糖尿病患者视网膜病变起保护作用。总之，上述研究均表明，Keap1/Nrf2/p62和NLRP3炎性小体与自噬之间相辅相成，在炎症和损伤性疾病中相互调节，相互作用。

5 药物的开发和治疗

Nrf2通路和NLRP3炎性小体以及自噬均参与了许多病理生理过程，和许多疾病的发展及治疗紧密相关。针对关键蛋白和重要信号通路设计和寻找药物，可达到治疗疾病的目的。研究表明，菊苣酸[15]和阿魏酸[33]可通过激活Nrf2/ARE/HO-1通路抑制NF-κB /NLRP3炎性小体来预防甲氨蝶呤诱导的肾毒性。短链脂肪酸可通过抑制NLRP3炎性小体和自噬对肠屏障功能障碍具有治疗作用[27]。冬凌草甲素可通过调节Nrf2介导的氧化应激和Nrf2非依赖性NLRP3炎性小体/ NF-κB通路对脂多糖诱导的急性肺损伤具有保护作用[36]。萝卜硫素可通过激活Nrf2和抑制NLRP3炎性小体对糖尿病患者视网膜病变具有治疗作用[37]。

6 小结与展望

自噬在NLRP3炎性小体激活和炎性因子分泌调节方面具有重要的作用，但作用是复杂的。此外，自噬在Nrf2系统调节细胞稳态，细胞死亡和存活等方面中也发挥着关键作用。Keap1/Nrf2/p62和NLRP3炎性小体通路对自噬均具有双向调节作用，因此揭示上述两个通路对自噬的调控机制及其作用将有助于于人们开发和治疗与自噬相关疾病的药物和策略，可为药物的发现和临床治疗提供新思路。