药用植物miRNA的研究进展△

张萌，孙芮，张楠，赵岩松

北京中医药大学 中医学院，北京 102488

微小RNA(microRNA，miRNA)是一种由内源性基因编码的非编码单链RNA分子，由约22个核苷酸组成。miRNA在动植物以及一些病毒中普遍存在。miRNA作为一种导向分子，通过碱基配对与靶mRNA结合，抑制靶mRNA转录后的剪切或翻译，影响蛋白质的表达，从而调节机体的生理功能[1]。有学者发现，miRNA在细胞分化、凋亡、增殖及肿瘤形成等不同调控途径中发挥着重要作用[2-4]。近年来，有关动物体miRNA，尤其是人体miRNA在疾病中的作用成为生命科学研究的焦点。

已有研究发现，外源的植物miRNA在人体内可稳定存在[5]，也有研究发现，一些中药中的miRNA具有一定的药理活性[6]。近年来，中药中所包含的植物miRNA成为新的研究关注点，本文对中药miRNA的研究现状进行综述。

1 中药中存在大量miRNA

自Lee等[7]首次在秀丽隐杆线虫突变体中发现miRNA以来，人们对这种长度为19～24 nt的非编码单链RNA进行了越来越多的研究。近年来成为各个学科研究的热点内容，从生命科学到临床医学，从植物培育再到食品安全等，miRNA广泛存在于自然界的动植物中。以动植物为主要来源的中药，其中也存在大量miRNA。近10年来，关于中药miRNA的研究飞速发展，韦春香等[8]利用高通量测序及生物信息技术预测到黄芪中所含的miRNA及其靶基因，并验证得到miR2118和miR166可能参与了黄芪的干旱胁迫应答；周怀香[9]利用高通量测序技术在不同品种天麻的箭麻与禾麻的花、茎、芽与块茎4个组织中测得大量天麻miRNA；向静等[10]也在甘草水煎剂中发现了丰富的甘草miRNA；马月等[11]在地黄中测得大量miRNA；同时，人参、丹参、桑叶等中药的miRNA也在研究中被发现[12-14]。

随着研究的不断推进，这些在中药中发现的miRNA与中药药效是否有关？miRNA广泛参与调控生物体的机能，那么植物miRNA是否能跨物种进入人和动物体内，调控人和动物的生理机能？其在人与动物的生理病理过程中又发挥什么作用呢？这些问题都值得深入研究与探讨。

2 中药miRNA可跨界进入机体

植物miRNA通常经过了甲基化修饰，较为稳定，不易降解[15]。植物miRNA的结构与人体miRNA的结构非常相似，但不完全相同。已经发现，外源性的植物miRNA可以通过消化系统或血液系统进入动物体内，调节组织和细胞的功能[16]。

早在2011年，Zhang等[17]就发现了植物miRNA可跨界调控动物的基因表达，他们采用solexa测序法检测了人血浆中的miRNA，发现约有30～50条外源性的植物miRNA，其中miRNA-156a和miRNA-168a的丰度较高。随后以玉米和大米等食物中广泛存在的植物miRNA-168a为研究焦点，研究者发现miRNA-168a可通过肠道吸收并稳定存在于哺乳动物的不同组织与器官中。随着研究的进一步推进，研究者发现，miRNA-168a可以通过与肝脏中相应靶基因mRNA低密度脂蛋白受体蛋白1(low-density lipoprotein receptor adapter protein 1，LDLRAP1)的外显子相互作用抑制其蛋白的翻译，从而影响血脂代谢，此研究开辟了植物miRNA跨界调控动物基因表达研究的新方向。此后，多项研究也证明，外源性的植物miRNA在动物血液和组织中可被检测到，并具有生物学功能[18-22]。

同样的跨界现象在中药研究中得以发现，这种跨界现象参与中药药效的发挥。王宇亮等[23]通过Northern印记杂交法验证丹参、生地黄水煎剂中miRNA的存在，并可经通过口服经消化道进入人体血液中；Zhou等[24]在2015年发现，中药金银花中的miRNA2911能在水煎液中稳定存在，并能够被人体吸收；随后Huang等[25]分别从10种中药水煎剂(半枝莲、柴胡、穿心莲、紫花地丁、黄芩、金银花、连翘、蒲公英、夏枯草、鱼腥草)中提取出miRNA，同时提取了人服用中药水煎剂后的血细胞和灌胃中药水煎剂的小鼠肺组织中的miRNA序列，进行大量生物信息学分析，计算发现其中有大量中药来源的miRNA。同时Du等[26]在红景天熬制的汤汁中提取鉴定了100多种脂质，其中大部分脂质也存在于中药蒲公英、穿心莲和金银花中，选取其中2种磷脂酰胆碱，使之与中药miRNA形成脂质体，发现该脂质体可促进红景天等miRNA进入人肺和胃肠道细胞。并且在体内外实验证明了从中药煎煮液中提取的具有热稳定性的成分疗效更好[27]，实验结果揭示了中药来源的miRNA通过脂质复合物进入人体的可能途径。诸多中药miRNA的研究结果也证明，中药miRNA也是中药的活性成分之一，其不同以往对中药的研究及其进入人体调节其他分子作用机制的研究，中药miRNA可以直接调控人体靶基因mRNA的表达，这为中药的现代研究提供了新的方向。

3 中药miRNA对机体的作用

3.1 调节脂质代谢

最早对中药miRNA进行研究的Zhang等[17]发现，存在于大米中的miR-168a可以从饮食中获取进入动物体内，并且在很多动物的血清和组织内均可检测到。同时发现，大米中存在的植物miR-168a可以与小鼠和人的脂蛋白中密度低的受体蛋白(即接头蛋白)的mRNA 结合，抑制肝脏中靶基因mRNA的表达，降低血浆中低密度脂蛋白的清除率，从而影响胆固醇的代谢。

3.2 调节免疫功能

邵红伟等[6]采用通用植物miRNA快速提取试剂盒提取甘草水煎剂中的miRNA，所得miRNA经DNaseⅠ处理后进行电泳鉴定；分别利用甘草水提物、甘草酸、甘草次酸和甘草miRNA处理体外培养的健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，24 h后，发现从甘草水煎剂中确实能够提取到miRNA，进一步印证了miRNA的稳定性。对体外培养PBMC作用结果表明，与空白对照组比较，经甘草miRNA刺激的PBMC发生了明显的抱团，细胞数量显著增多。随后，向静等[10]将从甘草水煎剂中提出的miRNA与合成的甘草miRNA模拟物作用于PBMC，进一步证明甘草的miRNA具有显著的免疫调节功能，随后通过RT-PCR对其模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)基因及一部分转录因子、信号分子和细胞因子的基因表达变化进行分析。结果发现，甘草的miRNA对人免疫细胞的基因表达具有明显的调节作用，能够明显抑制T细胞分化相关基因以及炎症和凋亡相关基因的表达。

3.3 抗病毒作用

2015年，Zhou等[24]在金银花的miRNA中发现了具有直接针对广谱的甲型流感病毒的miRNA2911。miRNA2911在金银花煎剂中高度稳定，连续饮用或灌胃给予金银花煎剂导致小鼠外周血和肺中miRNA2911水平显着升高。生物信息学预测和荧光素酶报告基因测定显示，miRNA2911可以靶向各种甲型流感病毒，包括甲型H1N1流感病毒、甲型H5N1流感病毒和甲型H7N9流感病毒。

3.4 抗炎症作用

周怀香[9]发现，天麻中Gas-miR01和Gas-miR02能够通过胃肠道进入小鼠体内，同时发现，Gas-miR01和Gas-miR02可以靶向核因子激活的B细胞κ-轻链增强(NF-κB)信号通路上的3个关键炎症相关基因A20、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和人核因子κB抑制蛋白α(IκBα)，表明天麻特有的2个miRNA分子可能是重要的植物miRNA，可以跨物种调控NF-κB信号通路上的相关基因，从而参与动物的免疫和炎症反应等重要生理过程。

Li等[27]在蒲公英的水煎剂中提取了一种由脂质、miRNA等组成的外泌体样纳米颗粒，命名为汤剂体。蒲公英汤剂体与蒲公英汤剂都降低了人非小细胞肺癌(A549)细胞中聚肌胞苷酸诱导的促炎因子生成。同时，由脂质和蒲公英miRNA等组成的汤剂体抗炎作用比蒲公英汤剂更强。

3.5 抗纤维化作用

Du等[26]从红景天的根部提取miRNA进行研究。首先，对红景天miRNA灌胃小鼠的肺组织进行高通量测序，人工合成在小鼠肺中发现的丰度最高的8条红景天来源miRNA序列，并在细胞模型上进行抗肺纤维化功能筛选。结果发现，HJT-s RNA-m7是其中抗纤维化功能最显著的miRNA。后续研究表明，HJT-s RNA-m7可以直接靶向肺纤维化发生发展中的关键蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白(fibronectin)及Ⅲ型胶原蛋白(COL3A1)，并在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中被证明具有较好的疗效。

3.6 调节肠道菌群

徐鹏程[28]对不同组小鼠在灌胃甘草水煎剂、灌胃甘草miRNA156和尾端注射甘草miRNA156后，取小鼠新鲜粪便提取基因组DNA进行测序分析，其中甘草miRNA减少了拟杆菌门，增多了变形菌门，证明甘草miRNA156对小鼠肠道菌群和肠道组织免疫系统均发挥着显著调节作用。

3.7 其他作用

Zhang等[29]在最新的研究中发现，中药冬虫夏草中的miRNA及其靶基因的表达作用与冬虫夏草的功效完全相同。该研究组采用高通量测序和生物信息学方法对冬虫夏草中保守的miRNA和新型miRNA进行鉴定。共鉴定出40个保守的miRNA，预测出31个新的miRNA和23个前体miRNA候选基因编码。此外，还预测了其在人体内的潜在靶基因，并对这些基因进行分析。生物信息学分析表明，保守型和新型miRNA的靶基因参与了发育、代谢和免疫的过程，起到抗肿瘤、降血压、刺激免疫系统的作用，为冬虫夏草的功效研究奠定了基础。

4 中药miRNA的研究意义

4.1 有利于进一步阐明中药作用机制

中药miRNA作为新发现的中药活性物质之一，不同于以往研究中中药有效成分的作用机制。中药来源的miRNA可以直接调节动物靶基因的表达，因此，对中药miRNA跨界调控作用的研究将极大推动中药作用机制的研究，最终形成中药miRNA-mRNA-蛋白质-疾病治疗的路线图。

4.2 为发展现代中医药理论提供切入点

随着现代科学研究方法不断改进，研究领域不断扩展，中医药理论也不断丰富其内涵。miRNA的发现更为现代中医药理论的发展提供了新的方向。中医归经理论是中医理论的重要组成部分，其是指中药作用的选择性和中药作用的方向性，即中药对人体不同部位的选择性作用。也就是说，某一种药归某一经脉，意味着中药有选择地对其所属的某一脏腑或经脉的功能影响较大，但对其他脏腑或经脉的功能影响很小或没有影响[30]。那么中药成分是如何在分子层面对疾病发挥作用的？不同中药进入人体后的靶点分布是怎样的？这种分布与中药的归经理论及对传统中药作用的认识有怎样的关联？这些问题都值得深入探索。中药miRNA为中药理论研究提供一种新颖的方法，也为揭开中药药理作用的微观本质，探索中药归经理论实质提供了新的研究思路和方法。

4.3 为中药核酸制剂的开发提供依据

miRNA技术不仅可以研究发病机制和药物作用机制，还可以作为核酸制剂研究新的药物。越来越多的研究表明，miRNA的模拟物或拮抗剂可以通过上调或下调机体中一些miRNA表达从而调控靶基因，以此来调节细胞功能，干预疾病发展[31-32]。随着RNA技术的进步及世界范围内第一个RNA干扰 (RNA interference，RNAi) 药物的诞生，加快我国中药miRNA开发创新的研究势在必行[33]。中药属天然药物，不良反应发生率低，具有较好的人体相容性，中药miRNA作为口服基因靶向治疗剂具有巨大潜力。同时，miRNA技术也是中药基因组学的重要组成部分，为深入挖掘中药的潜在功效提供有效的研究思路与技术手段。

5 问题与展望

中药是中华民族的瑰宝之一，但目前对于中药的研究，主要集中在次级代谢产物的研究上，例如黄酮、皂苷等。对初级代谢产物的活性研究，例如核酸、蛋白质等尚未引起广大研究者重视。随着miRNA作为中药活性物质可跨界调控机体功能被陆续证实，中药miRNA技术为中药活性成分及其对机体作用机制的研究提供了新的研究思路与方法。相信随着中药miRNA探究的继续深入，更广泛的中药药理作用会进一步被揭示出来，未来中医药将更受世界瞩目。