早发性卵巢功能不全相关信号通路研究进展

李德保，周 莉，孙祖越

(1.上海市计划生育科学研究所，中国生育调节药物毒理检测中心，上海 200032； 2.复旦大学药学院，上海 201203；3.国家人口和计划生育委员会计划生育药具重点实验室，上海 200032；4.复旦大学生殖与发育研究院，上海 200032)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是医学上应用很久的经典名词，其定义为女性在40岁之前就发生4～6个月的闭经，同时伴随卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)水平升高(FSH>40 U/L)而雌二醇水平降低。然而，POF只能代表卵巢功能衰竭的终末阶段，不能很好涵盖该疾病漫长而多变的临床过程。因此，2008年美国生殖医学学会(American Society for Reproductive Medicine，ASRM)正式采用“原发性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency)”的概念[1]，但由于原发性一般是针对继发性而言，这里的“原发性”已不是原意，引起了诸多困惑。2016年，欧洲人类生殖与胚胎学会(European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE)发表了最新的《POI处理指南》，将POI全称更改为早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)，且将FSH的诊断阈值(40 U/L)降为25 U/L，旨在更早发现POI女性，达到早诊断、早治疗的目的[2]。2016年12月中华医学会妇产科学分会绝经学组发表的《早发性卵巢功能不全的激素补充治疗专家共识》中[3]，国内相关专家将早发性卵巢功能不全定义为女性在40岁之前卵巢活动衰退的临床综合征，以月经紊乱(如停经或稀发月经)伴有高促性腺激素和低雌激素为特征。

任何阶段的POI归根到底都可能是由于原始卵泡数量减少、细胞凋亡或卵泡破坏增加、卵泡对促性腺激素刺激的无效反应所致[1]。目前的研究中，已经明确的病因有性染色体结构异常或某些常染色体基因缺陷、自身免疫性卵巢损伤、感染因素和医源性因素等，然而，仍有50%以上的POI病因不明[4]。了解与POI相关的信号转导通路对阐释POI的发病原因、恢复卵巢功能与寻找潜在的药物治疗靶点和诊疗新技术具有重要的意义。本文综述了与POI相关的信号通路研究进展。

1 TGF-β及其家族成员信号通路

1.1 TGF-β信号通路

转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是转化生长因子超家族中的一类多功能细胞因子，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3等多种亚型。一般直接参与信号转导的TGF-β受体由Ⅰ型和Ⅱ型受体亚单位组成，激活的TGF-β复合物与其他因子形成丝氨酸/苏氨酸激酶复合物，进而与TGF-β受体结合。与受体结合后，Ⅱ型受体激酶磷酸化并激活Ⅰ型受体激酶实现级联信号转导。这导致不同下游底物和调节蛋白的激活，诱导不同功能靶基因的转录[5]。TGF-β信号通路主要可以分为两类，一类由Smad(drosophila mothers against decapentaplegic protein)蛋白介导，称为经典通路。在此情况下，受体激活的Smad被Ⅰ型TGF-β受体激酶磷酸化，并与其他Smad蛋白形成复合物，后者能够转移到细胞核，从而诱导不同效应器的转录。还有一类是非Smad蛋白介导的信号通路，如通过激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路传导信号[6]。

TGF-β有多种生物学功能，参与生殖细胞的增殖分化和胚胎形成是其中重要的一部分，因此有学者对TGF-β信号通路在POI中的作用进行了探索。Mantawy等[7]在研究放射性治疗导致的POI时，发现Chrysin(5,7-二羟基黄酮)可以通过恢复雌二醇水平、维持正常卵巢组织结构和对抗滤泡丢失来预防POI。进一步研究发现，Chrysin对TGF-β信号通路和下游MAPK级联的抑制作用可能是其治疗放疗诱导的POI的机制。Zhang等[8]在研究人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，HAECs)对化疗药物导致的POI的治疗作用时发现，在与HAECs共培养的颗粒细胞中不仅检测到高浓度的TGF-β1，同时磷酸化的Smad2和Smad3蛋白表达量也明显高于未经治疗的化疗药物处理组，HAECs可以激活颗粒细胞内的TGF-β/Smad信号通路。由此可以看出，在不同的POI中，TGF-β含量的变化也不尽相同甚至相反，单纯检测TGF-β含量的变化是远远不够的，应该结合病理诊断结果，进一步探究其上下游信号分子，从而明确激活或者抑制的信号通路以及由此产生的效应。

1.2 TGF-β超家族其他成员信号通路

TGF-β超家族是一大类结构相关的细胞因子，主要包括TGF-β亚家族、骨形态发生蛋白与生长分化因子、激活素和抑制素亚家族等。除TGF-β外，还有一些家族成员介导的信号通路与POI有很强的相关性，在此一并介绍。

1.2.1 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)

BMP由Urist在1965年首次在成人骨组织中发现，并在之后的研究中被确定为TGF-β超家族中的亚家族(BMp-1除外)。利用基因敲除的小鼠，研究人员证明BMP亚家族成员BMp-15与POI密切相关[9]。此外，越来越多的临床案例[10]表明，BMp-15的基因突变导致人类产生POI，且在人类中自然发生的BMp-15突变产生的后果比在小鼠中更为严重，这可能与排卵和月经周期的差异有关[11]。利用大鼠原代颗粒细胞和人颗粒细胞细胞系COV434，Moore等[12]发现给予BMp-15可引起Smad1/5/8途径的快速和短暂磷酸化，从而激活Smad1/5/8途径。但在早期非洲爪蟾胚胎发生过程[11]中，发现BMp-15作为Smad1/5/8通路和Wnt通路的抑制剂发挥作用，BMp-15强烈抑制BMp-4诱导的BMP响应信号反应，阻断Smad1/5/8 MH2结构域的磷酸化和活化。

上述实验结果表明，在生殖发育过程中，BMp-15有时可能是激动剂的作用，有时也可能发挥抑制作用。实际上，当BMp-15抑制一种诱导物，如BMp-4时，Smad1/5/8信号通路被抑制；然而，如果BMp-15抑制另一种抑制物，将可能导致Smad1/5/8通路的激活。可能的解释是，不同的物种以及卵泡发育的不同时空，将会导致不同的信号阈值和信号时长，从而产生不同的调节效应，这充分说明了BMP调控的精确性和复杂性。此外，大多数BMP成员，如BMp-2、BMp-4、BMp-6和BMp-7，已经被证明在许多不同的细胞类型中激活了Smad信号通路发挥作用。

1.2.2 生长分化因子(growth differentiation factor，GDF)

在GDF亚家族中，与POI最密切也是最受关注的是GDF-9，GDF-9基因位于5号染色体的长臂上，研究发现GDF-9 mRNA仅在卵巢中高水平表达[13]，GDF-9的这种高选择性表达提示了其在卵巢中独特而重要的作用。已经有多项研究表明，在一些POI患者中，GDF-9基因位点的突变是主要的病因。另外，GDF-9的特殊性还在于有充分的证据表明GDF-9和BMp-15在遗传、生化和功能水平上存在协同作用[14]。与POI相关的BMp-15突变可降低其与GDF-9的协同作用，从而从另一个角度阐释了POI产生的原因[15]。通常，GDF-9 与受体间变性淋巴瘤激酶-5(anaplastic lymphoma kinase，ALK5)和II型BMP受体(BMPRII)结合后，诱导Smad2/3磷酸化，从而激活Smad2/3信号通路[16]，而BMp-15一般是结合受体BMPRII和ALK6并随后激活Smad 1/5/8信号通路；现在发现，BMp-15和GDF-9也可以通过形成异二聚体，与受体BMPRII-ALK4/5/7-ALK6复合物结合，激活Smad 2/3信号通路[17]。

1.2.3 激活素、抑制素、抗苗勒氏管激素

除上述之外，TGF-β超家族中的其他成员，如激活素(activin)、抑制素(inhibin)和抗苗勒氏管激素(anti-müllerian hormone，AMH)等，与某些特发性POI的形成也有一定的关系。激活素促进垂体前叶释放FSH，并在生殖生物学、胚胎发育以及炎症和纤维化的控制中发挥多方面的作用[18]；与之相对的，抑制素则是作为垂体FSH合成的负性调节剂或作为旁分泌因子在调节卵巢功能中发挥作用[19]；AMH则与功能性卵巢储备相关，因此在POI中常被用作诊断和预后标志物[20]。激活素结合到激活素Ⅱ型受体(ActRII或ActRIIB)上，使这些Ⅱ型受体磷酸化激活素I型受体(ActRIB)进而激活ALK4，活化的ALK4磷酸化细胞内信号蛋白Smad2/3，从而使Smad2/3蛋白与Smad4蛋白结合形成复合物，进而转移到细胞核而发挥效应[21]。尽管激活素信号转导途径已被广泛认知，但抑制素信号转导机制仍然是一个活跃的研究领域，暂没有完整的论述。AMH也有其被报道的通路，即AMH通常可以通过与Ⅰ型受体ALK2/ALK3或Ⅱ型受体(MISRII)结合，从而激活Smad 1/5/8信号通路[22]。

TGF-β超家族相关的信号通路与POI的发生发展有着密切的关系，为POI发病原因的阐释以及POI未来治疗方向提供了一定的参考。同时由于TGF-β超家族成员众多、信号调控网络精确而复杂，仍有许多地方值得作进一步探讨，如信号转导通路与POI关联性的强度以及治疗靶点的鉴定与筛选。目前的研究更多的是关注于筛选和报道更多POI相关基因，在利用这些发现探索内在的分子机制上还做得比较少。这其中，尤其值得注意的是BMp-15，在遗传因素导致POI的患者中，BMp-15缺陷占比较高，仅次于FMR1基因缺陷[19,23]。

2 PI3K-AKT和Hippo信号通路

磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信号通路是体内的基础信号通路，现在发现其不仅在调控肿瘤中具有重要作用，对卵巢休眠和初始卵泡激活也有重要意义。Hippo信号通路虽然是新兴的信号通路，但已经显示出该通路复杂多变，与其他信号通路存在诸多交联且参与调控卵泡发育。近年来，原始卵泡体外激活(in vitro activation of primordial follicles，IVA)为POI患者恢复生育能力提供了一种新的技术，而IVA便是基于PI3K-AKT信号通路和Hippo信号通路而开发的[24]。2013年Kazuliro等[25]首次提出该项技术并应用到临床，使POI患者成功妊娠并产下健康婴儿，展示出其重大的应用价值。

2.1 PI3K-AKT信号通路

对于PI3K-AKT信号通路，激活或抑制的AKT可以影响众多下游信号分子，研究较多并与POI相关性较大的为FoxO信号通路和mTOR信号通路，在此分别叙述。

2.1.1 PTEN/PI3K/AKT/FoxO3信号通路

磷酸酯酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)是PI3K/AKT信号通路的负调控因子，利用基因分析工具诱导切除成人卵母细胞中的PTEN，会导致AKT过度活化、叉头转录因子O3(forkhead transcription factor O3，FoxO3)过度磷酸化和FoxO3核输出，最终导致原始卵泡过度活化和POI[26]。而FoxO3缺陷小鼠表现出原始卵泡的全身激活，导致卵巢增生、卵泡耗尽、POI和不孕[27]。卵母细胞特异性切除PTEN和FoxO3导致了几乎完全相同的初始卵泡激活表型。进一步的研究表明，PI3K抑制剂抑制了PTEN基因敲除的卵巢表型，而不是FoxO3基因敲除的卵巢表型，表明FoxO3位于PTEN下游。对于卵泡激活，FoxO3是PI3K/AKT通路的主要效应器，而PTEN在卵母细胞内的基本作用就是调节FoxO3[26]。这些结果提示PTEN/PI3K/AKT/FoxO3通路的负调控可能导致卵泡激活延迟和原始卵泡闭锁，而PTEN的抑制和PI3K的激活可能导致休眠卵泡的激活。有趣的是，往往是由于PTEN/PI3K/AKT/FoxO3信号通路的过度激活导致POI的产生，但激活此通路又可以为不孕的POI患者带来治疗希望。这其实也表明了IVA技术的局限性，即无法对卵泡被完全耗尽而无休眠卵泡的POI患者应用此技术。

卵泡颗粒细胞具有广泛的能量生成和自由基清除功能，可能与POI有关，Ernst等[28]发现参与氧化防御的蛋白可能通过PI3K/PTEN/AKT信号通路调节初级卵泡颗粒细胞中的卵泡生长，通过抑制因子PTEN的负调节器发挥作用。Chang等[29]发现顺铂治疗降低了PTEN水平，使得PTEN/AKT/FoxO3途径被激活，增加了卵泡中FoxO3的胞质转运，迅速耗尽了休眠卵泡的数量，从而导致POI的产生。

2.1.2 PI3K/AKT/mTOR信号通路

哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其有两种复合体，分别为mTORC1和mTORC2。mTOR抑制基因Tsc1或Tsc2介导的mTORC1活性的抑制对维持卵泡池是必不可少的，且卵母细胞中mTORC1活性的增加会使原始卵泡池被提前激活，从而导致卵泡提前衰竭，产生POI[30]。人卵巢片段短期暴露于AKT刺激剂(PTEN抑制剂和PI3K激活剂)可促进卵泡生长，与mTOR激活剂联合治疗，可以进一步提高卵泡激活的成功率[31]。

临床上，电针疗法有时候会被推荐为POI的补充治疗手段，为了探究其内在的机制， Zhang等[32]对POI小鼠做了探究，发现PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响可能是起效的机制之一。类似的，有学者研究针刺治疗POI，发现治疗效果与雌激素治疗效果相当，作用机制可能与上调PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因和蛋白表达水平有关[33]。Li等[34]发现白藜芦醇通过激活雷公藤多苷诱导的大鼠POI模型中的PI3K/AKT/mTOR信号通路，减轻氧化应激，抑制颗粒细胞凋亡。利用携带人类FMR1前突变等位基因的小鼠模型，Lu等[35]发现FMR1前突变RNA可引起与FMR1前突变携带者相关的POI，进一步研究发现AKT和mTOR蛋白的磷酸化均降低，AKT/mTOR途径或许可作为此类POI的治疗靶点。有趣的是，与其他的报道不同，在这里，FMR1前突变使得AKT和mTOR蛋白的磷酸化均降低。因此，采用mTOR抑制剂的治疗方式，或许并不适用于某些遗传因素导致的POI。

值得注意的是，除了AKT外，mTOR还可以接受各种来自细胞内和细胞外的信号刺激，因此，其他信号刺激引起的mTOR信号通路的激活同样有可能与POI产生有关，如mTOR抑制基因Tsc的缺失。同时，就像Tsc和PTEN的双重缺失导致了原始卵泡激活的协同增强一样，PI3K/AKT/mTOR信号通路和其他信号刺激激活的mTOR信号通路在调节原始卵泡休眠中可能存在协同作用。

2.1.3 其他

最近的研究表明，PI3K/AKT信号通路途径在免疫和自身免疫中也起着关键作用[36]，人胎盘源性间充质干细胞(human placenta-derived mesenchymal stem cell，hPMSC)移植已被证明是一种恢复自身免疫性POI小鼠卵巢功能的有效方法，Yin等[37]的数据表明，PI3K/AKT信号通路通过改变POI小鼠hPMSC移植后辅助性T 细胞17(T helper cell 17, Th17)/细胞毒性T细胞17(cytotoxic T cell 17，Tc17)和Th17/调节性T细胞(regulatory cell，Treg)细胞的比率参与卵巢功能的恢复，这也提示了PI3K/AKT信号通路在治疗自身免疫性POI上的潜力。

此外，半乳糖血症是一种常染色体隐性疾病，由编码半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的GALT基因有害突变引起，尽管限制患者半乳糖饮食，但大多数典型半乳糖血症的女性会患有POI[38]。研究发现，GALT缺陷小鼠的内质网应激水平较高，并且PI3K/AKT信号通路下调。而沙丁醛(一种可以减轻内质网应激的物质)能有效地逆转突变细胞和动物体内下调的PI3K/AKT信号通路[39]。这不仅有助于理解半乳糖血症引发POI的原因，也为半乳糖血症POI的治疗提供了参考。

2.2 Hippo信号通路

Hippo信号通路是一个从肿瘤抑制基因Hippo(哺乳动物中为MST1和MST2)到肿瘤蛋白Yki(哺乳动物中为YAP和TAZ)的激酶级联信号通路。Hippo信号通路通过磷酸化使YAP/TAZ和其他转录因子失活，从而防止异常组织生长，是器官大小的调节器，在发育和再生的适当阶段阻止器官生长[40]。在多囊卵巢综合征中，双侧卵巢楔形切除术或激光打孔治疗这种机械性损伤程序可以促进排卵，虽然其中的机制还不十分明了，却对POI患者的卵泡激活是一个很好的启发。Kazuhiro等[25]发现，将卵巢组织切割成碎块的机械操作可以达到卵泡激活。这是因为，Hippo信号通路特异性地阻止原始卵泡的激活，将卵巢组织切割成碎片可以破坏这一途径。具体来说，因为卵巢碎片改变了细胞间的张力，促进肌动蛋白聚合，该聚合过程破坏卵巢Hippo信号传导，导致下游生长因子表达增加，促进卵泡生长，并产生成熟卵母细胞[24]。目前除了卵泡激活，Hippo信号通路在POI中的研究还比较少，仅有少量报道显示其可能是中药或天然产物作用机制的一部分。如Xie等[41]证明Huyang yangkun方通过Hippo-JAK2/STAT3信号途径修复POI大鼠的功能紊乱，增强POI大鼠的卵巢功能。Ai等[42]发现雷公藤多苷通过诱导内源性miR-15a表达和抑制Hippo-YAP/TAZ途径，促进卵巢颗粒细胞的细胞毒性、衰老和凋亡。

3 其他信号通路

除此之外，还有众多的信号通路在POI的发生发展和治疗中有一定的意义。如Wnt/β-catenin(βn连环蛋白，β环蛋白，-cat)信号通路与POI相关性较高，同时与PI3K-AKT信号通路存在交联。Rspo2杂合子缺陷雌性小鼠在4个月龄左右变得不育，类似于POI，而Rspo2则是典型Wnt/β-catenin信号通路的激动剂，体现了该通路与POI的相关性[43]。石斛多糖[44]、白藜芦醇[45]等天然产物一定程度上可以减轻POI损伤，这其中有核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路的参与，该通路与诸多细胞炎症因子相关。Notch受体信号通路参与调控生殖细胞减数分裂过程，Liu等[46]发现在临床前试验中曾被用于治疗POI的生长激素可通过激活卵巢组织中的Notch-1信号通路促进卵巢组织修复、雌激素释放和卵母细胞成熟。此外，像MAPK信号通路、NO/cGMP信号通路和p53信号通路等，由于这些通路在卵泡发育、减数分裂、氧化应激、细胞凋亡等过程中发挥一定的作用，与POI均有不同程度的联系。

4 小结

总而言之，与POI相关的信号通路众多，不同病因导致的POI所关联的信号通路也不尽相同。值得一提的是，从信号转导通路上来看，遗传因素导致的POI与其他因素所致POI在机制上有较大的区别，如前文所述，非遗传因素导致的POI基本都是过度激活了PI3K/AKT信号通路，但FMR1前突变使得AKT和mTOR蛋白的磷酸化均降低，GALT基因有害突变使PI3K/AKT信号通路下调。由于大部分POI具有特发性的特点，对于不同的患者，信号通路在其中的调控也有不同，因此不仅需要深入探究信号通路调控的方式，也对进一步加深理解POI疾病本身提出了要求。对相关信号通路的深入理解，有望为治疗POI打开新的思路。