睾丸发育相关基因1在肿瘤中的效应和机制

赵俞乔关沧海吴昊天胡增涛姜兴明

(哈尔滨医科大学附属第二医院普通外科,哈尔滨 150086)

长链非编码 RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度超过200 bp 的非编码调控RNA 分子,因其缺乏开放性阅读框而不具备或仅具备有限的蛋白质编码能力,曾被认为是基因转录的“噪音”[1]。近年来长链非编码RNA 相关的生理功能逐渐被阐明,越来越多的证据表明其参与染色质重塑、转录后调控、蛋白质翻译和组蛋白乙酰化等诸多生物学进程,并在多种人体恶性肿瘤中异常表达且与肿瘤细胞增殖及侵袭转移密切相关[2-4]。睾丸发育相关基因1(testis developmental related gene 1,TDRG1)是一个长度为1939 nt 的lncRNA,定位于人类染色体6p21.2 区域,能够编码100 个不具备任何已知蛋白结构域的氨基酸;最初认为该基因是一种仅在睾丸组织中表达的睾丸特异表达基因并推测其功能与精子发生相关[5-6]。目前研究表明:TDRG1 不仅在再生障碍性贫血中发挥作用[7],并且在多种恶性肿瘤中呈现异常表达,对肿瘤诊断、治疗和预后评估等方面有潜在的应用前景。本文就TDRG1 在肿瘤发生发展中的生物学效应和分子机制作一综述。

1 TDRG1 与恶性肿瘤

1.1 TDRG1 与宫颈癌

宫颈癌是全球癌症相关死亡的第三大原因[8-9]。范阳等[10]利用实时荧光定量聚合酶反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)对60 例宫颈癌患者肿瘤组织和邻近正常组织中的TDRG1 表达进行检测,结果显示TDRG1的表达在宫颈癌组织中呈明显上调;TDRG1 表达情况与临床数据的分析结果表明TDRG1 的高水平表达与癌肿分化程度及淋巴结转移密切相关;Kaplan-Meier 和log-rank 分析证实TDRG1 过表达患者的总体预后更差;多因素分析证明高表达TDRG1 是宫颈癌患者预后不良的危险因素[10]。在上述研究的基础上,Zhao 等[11]同样发现TDRG1 在宫颈癌中的异常高表达;并利用小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA)在克隆形成实验、MTT 及 Transwell 实验中敲低TDRG1 的表达后发现宫颈癌的增殖和迁移侵袭受到明显抑制。流式细胞术结果显示对照组细胞凋亡率由12.80%增加至36.8%,而siRNA处理的实验组细胞凋亡率由33.5%增加至53%,细胞凋亡率明显提高且细胞周期被阻滞于G1 期。生物信息学分析、qRT-PCR 检测和双荧光素酶实验结果表明TDRG1 与miR-330-5p 间存在特异性结合位点(GUCCCAGAG)且两者表达水平呈负相关(R=5.119,P＜0.0001),miR-330-5p 抑制剂能够部分逆转TDRG1 siRNA 对宫颈癌进展的影响。Western blot 结果显示:miR-330 - 5p 靶基因ELK1(ETS transcription factor ELK1)的表达与TDRG1 呈正相关而与miR-330-5p 呈负相关。上述实验结果提示:TDRG1 通过充当miR-330-5p 的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)上调促癌基因ELK1 的表达来促进宫颈癌的恶性进程。此外,Jiang等[12]的研究表明TDRG1 的高水平表达与 FIGO(international federation of gynecology and obstetrics)分期以及癌肿浸润深度密切相关,同时发现TDRG1的另一海绵吸附靶点miR-326;进一步研究发现,miR-326 能 与 促 癌 基 因MAPK1 的 3’-UTR(untranslated region)相结合,抑制TDRG1 可降低MAPK1(mitogen-activated protein kinase 1)的表达,即TDRG1 能够通过TDRG1/miR-326/MAPK1 轴调节宫颈癌的发生和发展。

1.2 TDRG1 与上皮性卵巢癌

研究指出lncRNAs 在上皮性卵巢癌(epithelial ovarian carcinoma,EOC)中的作用与机制对肿瘤治疗和患者预后评估有重要作用[13-15]。Chen 等[16]利用qRT-PCR 定量检测95 例上皮性卵巢癌患者的组织样本后发现:相比于正常卵巢组织,EOC 肿瘤组织内TDRG1 呈明显上调,并且其表达水平与肿瘤的分化程度密切相关(P=0.043)。体外细胞实验中构建质粒表达载体外源性上调TDRG1 能够促进肿瘤细胞的增殖和迁移侵袭能力并抑制细胞凋亡发生,利用siRNA 干扰TDRG1 的表达则会得到与上述相反的结果。生物信息学预测和双荧光素酶报告实验证实TDRG1 与miR-93 之间存在结合位点,并且两者在肿瘤组织内的表达水平呈负相关;Western blot 实验结果显示TDRG1 能够上调miR-93 靶基因肿瘤转移关键基因RhoC(ras homolog family member C)及RhoC下游因子(P70S6K、Bcl-xL、MMP-2)的表达进而促进EOC 的侵袭转移。

1.3 TDRG1 与子宫内膜癌

近年来子宫内膜癌的发病率由于肥胖症和代谢性疾病患者增加而趋于年轻化[17]。Sun 等[18]的研究证实在子宫内膜癌肿瘤组织和肿瘤细胞中TDRG1 呈上调表达,利用siRNA 外源性沉默TDRG1表达能够抑制肿瘤细胞的增殖和迁移侵袭,并且发生凋亡的细胞比例明显升高。Western blot 检测结果表明在肿瘤细胞中转染siRNA 后与肿瘤侵袭和转移密切相关的MMP-2(matrix metallopeptidase 2)和MMP-9(matrix metallopeptidase 9)表达降低,同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 并诱导细胞凋亡标志物Bax 和裂解型caspase3 的表达;TDRG1 过表达能够上调肿瘤细胞中 p-pi3k、p-AKT 和p-mTOR 的蛋白表达水平而外源性沉默TDRG1 后上述蛋白表达下降,这提示PI3K/AKT/mTOR 信号通路参与TDRG1对子宫内癌膜恶性生物学行为的调控。进一步的RIP(RNA binding protein immunoprecipitation) 和Western blot 实验结果表明:TDRG1 能够直接与VEGF-A(vascular endothelial growth factor A)结合并促进其表达,高表达VEGF-A通过上调抗凋亡蛋白 PI3K、Bcl-2、MMP-2 和 survivin 的表达从而发挥促癌作用。综上,TDRG1 可以调控VEGF-A和相关基因的表达来促进子宫内膜癌的增殖和迁移侵袭[19]。

1.4 TDRG1 与胃癌

胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤,也是癌症致患者死亡的主要原因[20-21]。Ma 等[22]利用 qRTPCR 测定42 例胃癌患者肿瘤组织和癌旁正常组织中TDRG1 的表达水平,结果显示胃癌组织中TDRG1呈显著高表达;根据TDRG1 表达水平将胃癌患者分为TDRG1 高表达组和TDRG1 低表达组,同时对胃癌患者的临床病理数据进行统计学分析,数据结果发现TDRG1 高表达与肿瘤的临床分期、远处转移及患者较差的预后密切相关。随后的体外细胞实验,通过MTT、细胞划痕实验和Transwell 实验检测,结果表明上调TDRG1 表达后胃癌肿瘤细胞SGC-7901和MGC-803 的增殖及迁移侵袭能力明显提高;在裸鼠成瘤实验中过表达TDRG1 的体内移植瘤的生长速度加快。生物信息学分析和RNA 免疫沉淀实验证实TDRG1 可以海绵吸附抑癌基因miR-873-5p 来降低其表达;双荧光素酶实验证实miR-873-5p 与促癌基因HDGF(heparin binding growth factor)间存在靶向结合调控关系,定量检测结果显示胃癌肿瘤组织内两者表达呈负相关。综上,胃癌中高表达的TDRG1 通过对miR-873-5p/HDGF轴的调控来促进肿瘤的恶性生物学行为。

1.5 TDRG1 与非小细胞肺癌

肺癌约占所有肿瘤的19.4%,而非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌病例的近 80%[23-24]。Hu 等[25]收集了 34 例非小细胞肺癌的病理组织样本,利用qRT-PCR 检测发现TDRG1 在NSCLC 组织中的表达与癌旁组织相比显著提高。MTT 实验结果显示TDRG1 的特异性siRNA 转染A549 和H1975 细胞后,肿瘤细胞的增殖受到明显抑制,而过表达TDRG1 能促进非小细胞肺癌细胞的生长。细胞划痕实验和Transwell实验证实沉默肿瘤细胞内TDRG1 的表达能够明显抑制细胞迁移和侵袭转移。Western blot 实验发现肿瘤细胞内TDRG1 的表达与E-cadherin 呈负相关而与N-cadherin 呈正相关,这表明TDRG1 能够促进上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程。进一步实验证实 miR-206 与TDRG1的3’-UTR 存在 10 个互补序列同时与ZEB1(zinc finger e-box binding homeobox 1)也存在特异性结合位点;上述实验研究结果提示TDRG1 能通过靶向结合miR-206 进而上调促癌基因ZEB1的表达。

2 结语及展望

TDRG1 作为一种新发现的lncRNA,其在肿瘤内功能的相关研究尚处于初始阶段,不同肿瘤内TDRG1 的异常表达水平以及更深层面的调控机制有待于后续的进一步探索。相信随着实验技术的发展,TDRG1 在肿瘤发生发展中作用机制的相关研究将更加深入,并且为肿瘤的早期诊断、综合治疗及患者预后评估指明新的方向。