外泌体新型药物运载系统的研究进展

刘 艳，戴 鹏，朱运峰

（1.北京交通大学生命科学与生物工程研究院，北京 100044；2.河南省华之源生物技术有限公司，河南 郑州 450000）

胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）是细胞分泌的脂质双分子层膜包绕形成的囊状结构，一般直径介于30～5000 nm之间，几乎所有种类的细胞都可向其所生存的微环境中分泌产生EV［1-2］，而外泌体（exosome）则是来源于内吞途径的纳米级EV。目前认为外泌体是由各种细胞分泌的、直径大小在40～100 nm之间多形性囊泡样小体结构，是细胞间信号传递的“膜信使”；而且外泌体包裹的分子物质可避免被体液中的酶降解，这一特点使外泌体成为新型的天然药物运载系统。本文将对外泌体的生物功能、外泌体载药系统及其临床应用的可能性进行概述。

1 外泌体

早在20世纪40年代，CHARGAFF等［3］发现，在健康人血浆中EV可以作为血小板的微颗粒促进凝血；70年代中期，DE BROE等［4］发现，直肠癌微绒毛细胞能向微环境中释放质膜囊泡；直到80年代初期，PAN等［5］发现，在网织红细胞向红细胞成熟的过程中，从细胞培养液中能分离出一种大小约为50 nm、含有转铁蛋白受体的囊泡样结构物质，将其命名为“外泌体”。90年代末期，ZITVOGEL等［6］发现，经肽脉冲技术处理的肿瘤树突状细胞来源的外泌体以T细胞依赖性方式消除或抑制肿瘤的生长。近年来，随着细胞生物学和分子生物学等研究技术不断发展，已发现外泌体广泛存在于血液、尿液和乳汁等多种体液中。

1.1 外泌体的来源

外泌体是来源于内吞途径的纳米级EV。内吞作用是细胞通过质膜内陷使细胞质、大分子、膜和受体内化的过程，在膜断裂后成为细胞内囊泡。初级内吞囊泡与早期内体（early endosome）融合，启动“货物”分选。早期内体成熟为晚期内体（late endosome），并最终与溶酶体融合。在成熟期间，一些内体会产生许多以管腔内囊泡（intraluminal vesicles，ILV）为特征的中间细胞器，被称为多泡体（multivesicular bodies，MVB）。MVB与质膜融合释放ILV至细胞外空间，从而产生外泌体［7］。外泌体是细胞释放到外界的EV中的一类。EV还包括较大的囊泡，如微囊泡、凋亡小体以及源自质膜的较小的囊泡，如核外颗粒体。

1.2 外泌体的生理功能

由不同种类细胞分泌的外泌体，其内容物的含量也十分丰富。其中包括组成外泌体结构蛋白和特异性蛋白。此外，外泌体内腔中还检测到多种核酸成分，其中包括mRNA、miRNA、长链非编码RNA和环状RNA等。随着外泌体研究的深入，逐渐发现外泌体具有多种功能，如外泌体在细胞间物质传递和信号转导过程中起着重要的通讯载体的作用。目前研究发现，多种类型的细胞如各种造血系统的细胞、多种干细胞和前体细胞及许多细胞株在体内环境或体外培养条件下均能产生并分泌外泌体。由于外泌体的母细胞来源不同，所以不同类型和起源的外泌体的成分和功能也不同。在不同生理和病理条件下外泌体都能发挥作用，一方面调节诸如干细胞维护、组织修复、免疫监视和凝血等生理过程，另一方面还参与了肿瘤的发生发展、肿瘤的转移及病原体感染等诸多病理过程［8］。

截止目前，由于外泌体所具有的特殊纳米级结构以及生物学功能特点，针对外泌体的临床研究主要集中在以下2个方面：一方面是通过生物学技术分析外泌体在生理和病理状态下发挥调节作用的详细分子机制，明确其生理和病理过程，并期望能通过外泌体自身所携带的特异性蛋白和核酸等分子作为肿瘤早期诊断标志物以及临床治疗的药物靶点；另一方面，基于外泌体自身的结构特点和生物学功能，其作为药物载体和治疗系统用于临床恶性肿瘤疾病的治疗成为近年外泌体研究的热点。外泌体可作为天然的药物运载系统，将治疗分子、药物等运送至靶细胞，进而发挥治疗作用。

2 外泌体载药系统

2.1 外泌体载药系统的应用

外泌体来源于机体细胞，可作为天然的生物载体，能进行长距离的细胞间物质输运和信号传递［9-10］。这种细胞间的通讯在机体的生理和病理过程中至关重要［11］，已被用于多种疾病和肿瘤的治疗与组织损伤修复等疾病的研究［12-13］。主要方法分为2种：一是某些特殊细胞分泌的外泌体包含有治疗作用的有效分子，可将外泌体作为生物药物应用于免疫抑制和活化、血管生成以及组织损伤修复等；另一则是利用工程化改造后的外泌体作为药物载体将治疗药物运送至治疗部位［14］。

近年来，外泌体载药系统一直是众多研究者关注的焦点。2010年，SUN等［15］在早期的动物实验中对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的脓毒性休克小鼠模型进行腹腔注射含姜黄素的外泌体。结果表明，外泌体可用作抗炎药物的体内载体。自此，揭开了外泌体介导药物传递系统研究的新篇章。他们改用鼻腔内注射，结果发现，载有姜黄素或信号传导与转录激活因子3抑制剂的外泌体可用于治疗LPS诱导的脑炎症、实验性自身免疫性脑炎和GL26脑肿瘤模型［16］。随后又有研究者发现，向野生型小鼠静脉注射携带小干扰核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）序列的外泌体，能显著抑制阿尔茨海默病治疗靶点β-淀粉样前体蛋白裂解酶1的表达［17-18］。实际上，电穿孔、超声、低渗透析、反复冻融、挤压和细胞介导等许多不同的方法迄今已用于各种治疗药物包括小分子、纳米颗粒、蛋白质和寡核苷酸等的外泌体装载［19-21］。除此之外，越来越多的研究表明，外泌体载药系统在癌症［22-24］、脑梗死［25］和神经退行性疾病［26-27］等各种疾病模型的研究中也都显示出比较理想的治疗效果。

此外，外泌体的生成是一个自然过程，与其他人工合成的载药系统相比，其装载方案有多种，如分泌前细胞工程装载和纯化后外泌体装载。但需要注意的是，外泌体装载合成的反应条件可能会对外泌体及其母细胞产生不利的影响［19］，而且体外实验和体内动物模型实验都需要大量的母细胞分泌产生足够的外泌体。因此，如何提高外泌体载药系统的产量应用于临床疾病的治疗将是一个挑战［28］。同时，利用外泌体进行体内药物递送时还必须考虑以下因素：①外泌体和细胞之间相互作用的模式是否与所递送的治疗剂作用机制一致，是否会对所递送的治疗剂功效有所影响；②外泌体广泛参与了机体的生物过程，大量的外源性外泌体的存在可能会破坏内源性外泌体介导的细胞间通讯；③一些尚不明了甚至未知的机制可能会导致不良副作用，如外泌体表面蛋白质的脱靶信号转导，还有其他如癌基因［29］和病毒miRNA［30］，或朊病毒颗粒［31］以及外泌体纯化过程中未能去除的可溶性颗粒因子［32］等物质在外泌体中一起递送，均有可能产生不良副作用。提示纯化方案中采用严格的质控与安全性分析使这些复杂的影响因素最小化，对体内和体外研究至关重要［33］。

2.2 外泌体载药系统的优势

近年来，药物载体层出不穷，基于脂质体的载体和基于聚合物的载体是目前广泛研究的2类药物载体，然而一般的纳米载体在体内循环时易被肝和脾网状内皮系统巨噬细胞吞噬，且血液中循环时间短，稳定性差，靶向性低［34-35］。然而，外泌体作为来源于细胞的纳米级囊泡状结构，具有天然的生物学起源和复杂性，在细胞间信息交流的过程中起着重要作用，并且它在人体内分布广泛，可穿过细胞膜，不易引起免疫反应，作为药物载体具有独特优势，为基因、抗肿瘤等药物的输运开辟了一条新的道路。

首先，外泌体天然的生物学起源为细胞内源性治疗因子的产生和装载提供了特有的机会。此时，治疗药物、寡核苷酸和纳米粒子等可被送入细胞，随后重新包装成分泌的囊泡［18，26］。利用细胞产生、装载和分泌释放载药外泌体使治疗药物装载过程得到简化，为特定位点（如内腔和囊泡膜）的药物装载提供了基础，并且还使不易装载的物质具有更高的吸收效率和传递效率。

其次，外泌体可穿透某些生物屏障如血脑屏障（blood-brain barrier，BBB），到达治疗靶点进行给药。如WIKLANDER等［36］的研究指出，非靶向的外泌体可在肿瘤部位累积。外泌体还能利用实体瘤的增强渗透滞留效应，优先透入肿瘤组织的血管壁，促进大分子物质在肿瘤组织中的选择性分布［37］。大脑是药物递送的又一重要靶标，研究发现，在小鼠模型中利用外泌体装载姜黄素和过氧化氢酶也证明其在神经保护方面的作用［16，27］。此外，鼻内递送也可作为穿过BBB进行外泌体载药系统递送的理想给药途径［38］。TOMINAGA等［39］的研究中还发现，纳米级EV结构可能具有绕过BBB的内在机制，为药物递送至大脑提供新思路。

第三，研究者认为，体内某些外泌体具有很强的稳定性，可避免被巨噬细胞吞噬和溶酶体所降解，为体内外泌体载药系统的长时间循环和长时间暴露于炎症等刺激环境时提供保护［40］。也有报道称，不同母细胞来源的外泌体，向不同类型的细胞输运内容物的效率不同［41］。所以，了解和利用细胞选择性相互作用的机制，可使装载药物的外泌体更易于靶向治疗部位。

2.3 外泌体的工程化改造

由于外泌体中含有大量的蛋白质和核酸，因此外泌体能将这些物质转运至靶细胞，对机体生物学功能发挥调控作用。基于外泌体自身的结构特点和生物学功能，其作为药物载体和治疗系统用于临床恶性肿瘤疾病的治疗成为近年外泌体研究的热点。

外泌体是细胞衍生的纳米囊泡（30～100 nm），介导细胞间通讯，又是候选的治疗剂。但外泌体信息传递（如mRNA）效率低及缺乏设计外泌体的方法阻碍了它们治疗干预的发展。目前的大部分研究是通过基因工程技术将靶向肽定位到外泌体膜上，从而使外泌体获得靶向性。ALVAREZ-ERVITI等［17］对树突状细胞进行狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RVG）-溶酶体相关膜蛋白（RVG-Lamp2b）的表达质粒转染，从而使树突状细胞分泌的外泌体上连接有RVG多肽，最后将重组人β-淀粉样前体蛋白裂解酶1 siRNA和GAPDH siRNA质粒利用电穿孔技术装载到连接RVG肽的外泌体中，最终获得具有靶向性的RVG-Exo外泌体复合物。此外，KOJIMA等［42］报道了一套外泌体转移到细胞的设备，可在设计的哺乳动物细胞中高效产生设计好的外泌体，实现有效的细胞间通讯。TIAN等［43］通过一种简单、快速的化学方法将具有靶向性的工程化环肽〔cyclo（Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys）peptide，c（RGDyK）〕与外泌体表面缀合。一方面，在短暂的大脑中动脉闭塞小鼠模型中，经c（RGDyK）修饰的外泌体〔c（RGDyK）-conjugated exosomes，cRGD-Exo〕在静脉内给药后可靶向缺血性脑损伤区域。另一方面，将姜黄素加载到cRGD-Exo外泌体上，外泌体的施用对病变区域的炎症反应和细胞凋亡具有强烈的抑制作用。该研究表明，外泌体作为靶向缺血性脑损伤的递送载体的可能性，并提供了快速和大规模生产功能化外泌体的策略。

3 结语

药物的靶向输送系统是保障药物到达靶向部位的有效手段，使靶部位的有效药物浓度最高，从而达到最佳治疗效果。因此，需要对所设计的外泌体载药系统是如何体内输运、达到预定靶组织以及运送治疗药物等有充分的了解。一方面是外泌体局部靶向组织给药，如鼻内递送至脑组织［16，27］或直接肿瘤皮下注射［44］；另一方面是外泌体全身给药，这其中就存在流体动力学、生物学屏障和免疫清除之间复杂的相互作用。对于脂质体而言，人们对其大小、电荷以及灵活性的细微变化是如何调控其在血液中的体内循环、穿透屏障等均有相对全面的了解［45］。但对于外泌体来说，还要考虑更多的影响因素［40-41］。除此之外，需要注意的是，外泌体载药系统的临床转化研究与非临床研究具有一定的差异。例如，某些生物屏障的大小在动物模型和人类之间就存在显著差异［45］。

上述外泌体优势的具体利用取决于临床治疗时的具体情况，其中包括药物的化学性质、递送方式、靶组织和作用机制等，这些特征与负荷效率、细胞摄取、给药途径和潜在副作用等密切相关。因此，对于每个载药系统，必须仔细权衡所采用的外泌体优势与局限性，而且临床转化仍需要提高有效的外泌体分离、药物负载技术及详细的外泌体生理学功能知识。相信随着外泌体药物输送机制以及健全药物输运机制等难题的克服，外泌体介导的药物输送将在临床上得到广泛的应用。