NGS在下呼吸道感染病原学中的应用

彭钰涵 邱小建 张杰

下呼吸道病原体的感染主要包括细菌、病毒、真菌及其他非典型微生物，而用于识别呼吸道病原体的传统方法包括微生物培养、痰涂片染色、尿抗原检测和血清学检测等，这些传统方法可以在一定程度上帮助识别呼吸道病原体。然而，它们都有各自的缺陷，比如：敏感性差，耗时较长，缺乏专业培养基，延迟应答等[1]。随着人类对探索生命奥秘的渴求，作为研究细胞结构和功能基础的DNA测序技术得以迅速发展。20世纪，Sanger测序法(也被称为第一代测序法)应运而生，它具有高效率和低放射性，但也因成本过高、耗时、不够精准等原因发展受限。为使基因测序更加便捷，同时降低成本，能大规模并行分析基因、具有高通量优点的下一代测序技术(next-generation sequence,NGS)得以研发并被广泛应用于各个领域[2]。目前NGS可作为研究病原体特征的一个工具，在了解病原体的毒力特征、预测疾病严重程度、感染结果以及疾病早期发病期间进行风险评估等方面起着至关重要的作用[3]。本文就NGS在下呼吸道感染病原学中的应用展开论述。

1 NGS代表平台

新一代测序技术兴起之初，有3个典型的代表平台及相应的系统，分别是Roche的罗氏454系统、Life Science的SOLiD/Torrent PGM系统、Illumina平台的GA/HiSeq/Miseq系统。其Ion Torrent PGM和Illumina MiSeq因其小体积和快速周转率等优势，在临床和小型实验室中得以广泛应用[2]。在Castelino等[4]的研究中，基于细菌16S rRNA基因的V3-V4高变区来捕获NGS的群落多样性，比较了Illumina MiSeq与Roche 454 系统，并证实二者捕获了相同的细菌多样性，但Illumina MiSeq在吞吐量和成本效益显示出优势。Quail等[5]研究表明，Ion Torrent平台的错误率高于Illumina平台。据统计，随着罗氏454测序平台即将停产以及SOLiD和IonTorrent系统的低采用率，细菌基因组测序几乎全部在Illumina测序仪上进行[6]。

Illumina的代表系统主要有MiniSeq，MiSeq，NextSeq，Hiseq，HiSeq X Ten，NovaSeq等系列。2013年，Miseq作为第一个NGS平台由美国食品药物管理局(FDA)批准用于临床，已多次应用于临床微生物检测，是目前较为可靠的病原学检测手段。NextSeq是illumina第二款获批平台，可在高产量和中等产量两种模式下展开测序，与Miseq相比，更加灵活、经济，但目前应用于呼吸道病原检测的相关研究不多。

随着测序技术的发展，第三代测序平台PacBio的Sequel/RSI系统可弥补Illumina的短读缺陷，也在速度上具有优势，但其成本远高于Illumina。另一种能够进行单分子测序的测序技术是ONT MinION技术(也被称为第四代测序)，是目前市场上产量最高的平台，与Illumina相比，在成本、运行时间、输出方面均有优势，但目前尚是一项正在开发的技术，错误率、标准化等问题也有待解决[7]。

2 NGS在检测不同下呼吸道病原体中的作用与特性

2.1 病毒 病毒是下呼吸道感染中不可忽视而又难以准确检测的病原体之一，目前的检测方法有抗原检测、PCR、病毒分离、血清学IgG及IgM等[8]。而病毒特异性分子检测被认为是诊断呼吸道病毒的金标准，具有快速、价格低，并比现有的技术(如病毒培养、直接荧光免疫)有更高的灵敏度和特异性。但该技术受靶向病原体数量的制约，而且需要持续监测以确保灵敏度及特异性，以及不断的更新信息库以覆盖新出现的病原体。而NGS可以解决这些问题并可能彻底改变呼吸道病毒诊断[9]。Bialasiewicz等[10]将RT-PCR与新一代测序方法组合起来，发现了一株副流感病毒4(PIV4)的变异菌株，证实了RT-PCR与新一代测序技术组合的方法在识别新型病毒病原体中的效用。在Thorburn等[9]的研究中，NGS可以为检测到的病毒提供更详细的类型信息，包括病毒的亚型数据及血清型数据，在此基础上还可提供抗性测试，如甲型流感的H275Y突变，赋予了奥司他韦抗性，这对爆发性流感的诊治起到不可替代的作用。未来，它还可能检测出与疾病严重程度相关的病毒多态性。这种优势不仅体现在病毒诊断上，更能指导临床进行有针对性的用药，避免抗生素滥用，减少多重耐药病原体的感染。

2.2 细菌 下呼吸道细菌感染主要有肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性杆菌等，相关的检测方法主要包括革兰氏染色、痰液、支气管肺泡灌洗液或其他下呼吸道分泌物的培养、血培养、血清学研究、抗原检测、PCR等，但这些检测方法受标本污染、抗生素应用等情况的制约，目前尚未有理想的检测方法[8]。在Abayasekara等[11]的研究中，采用NGS方法针对细菌16S rRNA基因区域检测所得结果与常规培养结果进行对比，并以培养结果作为金标准，分析比较了各种临床样本(其中包含气管分泌物及痰标本)，并通过NGS检测多种链球菌类、葡糖球菌属、克雷白杆菌属等菌类。结果证实基因检测结果与培养阳性的一致率可达91.8%。在Mellmann等[12]的研究中也证实了NGS在应用于细菌基因分型中的高度重复性及准确性。

2.3 真菌 在检测真菌感染方面，He等[13]报道了3例重症肺炎烟曲霉菌感染的病例，采用NGS对肺泡灌洗液样本进行检测，其中2例经传统方法、NGS证实，1例仅通过NGS证实(其他常规结果阴性)，在获得NGS结果后，应用单独抗真菌药物治疗后恢复(此前均未接受任何抗生素治疗)。Abayasekara等[11]采用了真菌ITS1基因区域的下一代测序对呼吸道标本进行真菌感染检测，由于未能有培养结果对比，尚无法评估，但其检测结果中10.3%的标本测得真菌阳性，也在一定程度上证实了NGS检测真菌的能力。NGS在真菌检测上的突出优势不仅在于检测出多种真菌，还可以检测出耐多药菌株突变的耐药基因，分析其多种耐药机制[14,15]，从而为临床治疗提供参考。

2.4 其他病原体

2.4.1 检测结核分枝杆菌(MTB)：基于其独特的生理学及基因组成，合理选择文库构建十分重要，在Tyler等[16]的研究中表明，MTB NGS数据质量高度依赖于提交测序的DNA样品的纯度及其鸟嘌呤-胞嘧啶含量(或GC含量)，而Illumina TruSeq文库制备试剂盒可以产生比Nextera XT方法更均匀的数据质量，这为检测结核杆菌提供了更加准确的方向。Walker等[17]应用Illumina技术对MTB基因进行测序，通过这种方式识别超级传播者及潜伏期的患者，使得感染的患者及其接触者得到早期治疗。应用这种技术还可确定传播过程的微进化事件，即确定每个导致继发性病例的传播事件的0～2个单核苷酸多态性，从而掌握传播链中新的流行病链接[18]。目前NGS应用于MTB传播方面的研究较多，充分展现出基因检测在阻止结核传播中发挥的优势。

2.4.2 鉴定肺炎支原体感染：包括病原体特异性抗原或核酸的培养，血清学分析或分子检测，如前文所述，这些检测有弊端，如耗时长、特异性及敏感性差等。而基因组测序有可能彻底改变肺炎支原体生物学和流行病学领域，并在了解可变数目串联重复序列(VNTR)变异和改进支原体基因分型的潜在多位点VNTR分析方案上提供了新见解，具有更好的鉴别能力[19,20]。

3 不同下呼吸道标本的特点及其在NGS诊断中的应用

3.1 血标本 病原体的血清学检测及血培养常规应用于下呼吸道感染病原体检测，但耗时长、阳性率低。可以无偏倚地测定全部核苷酸序列的新一代测序技术可直接检测血标本，这在一定程度是避免了难以培养的病原体的漏检。Long等[21]的研究采用NGS和培养2种方法对78例ICU患者血浆标本进行分析，通过PCR及Sanger测序进行验证，同时以10例健康患者NGS的血浆标本结果作为阴性对照，结果NGS在15例标本检测出细菌或真菌，14例检测出病毒感染(其中9种由Sanger测序验证)，培养诊断10例含细菌、真菌的标本，7例标本经NGS和培养共同诊断为细菌或真菌感染。该研究认为：(1)整体诊断敏感性由培养的12.82%(10/78)提高到NGS的30.77%(24/78)，证实NGS可提高诊断敏感性。(2)如果以培养作为诊断的金标准(细菌或真菌被培养出即阳性)，NGS细菌分析的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和约登指数分别为72.7%、89.6%、53.3%、95.2%和62.3%。采用McNemar’s χ2test 检验，阳性和阴性结果差异无统计学意义(P=0.343)；一致性检验表明，培养与NGS两种方法具有一定的一致性(k=0.54，P<0.001)。(3)当NGS和培养联合时，被鉴定为阳性的样本从12.82%(10/78)增加到23.08%(18/78)。McNemar’s χ2检验差异有统计学意义(P=0.013)，证实NGS与培养联合的诊断率优于单一培养。

3.2 痰标本 痰标本涂片与培养是临床中常用的方法，采集方法主要有经口咳出、吸痰管吸引、经支气管镜采样等。经口咳出容易受口咽部定制植菌污染等影响，经吸痰管吸引多用于建立人工气道的危重患者，可能损伤气道黏膜，加重缺氧，引起肺不张等后果，经支气管镜采集痰标本创伤较小，出于费用、耐受性方面考虑，目前也难以作为常规性检查，但对于重症及难治性下呼吸道感染患者有较大意义。Dunlap等[22]报道了1例重症细菌性肺炎患者NGS的气管内抽吸物的回顾性研究，该患者入院后血培养示坏死梭杆菌，痰培养示呼吸道正常菌群，气管内抽吸物及支气管肺泡灌洗液培养均阴性，后对胸腔积液进行细菌学检查示人支原体，应用阿奇霉素后好转出院。该研究回顾性应用NGS对于第1、3、7天的气管内抽吸物进行检测，均检测出梭杆菌及支原体，该研究认为对危重患者提供及时NGS结果，有利于诊断及及时治疗。Kalantar等[23]选取了52例急性呼吸系统疾病患者，其中15例是由培养证实的细菌性肺炎患者，12例急性呼吸衰竭非肺炎患者，25例临床疑似肺炎的急性呼吸道疾病患者(培养阴性)。通过Illumina 平台对支气管肺泡灌洗液与气管内抽吸物标本进行气道微生物群评估，其中肺泡灌洗液标本的mNGS检测了全部23种培养鉴定的微生物，气管内抽吸物标本的mNGS检测了22种微生物。有差异的微生物来自多微生物培养标本，在气管内抽吸物标本中被mNGS检测，但相对丰度低于1%，根据生物信息背景，未列入内。该研究认为:(1)两种标本物种丰度差异不大：认为肺泡灌洗液与气管内抽吸物间属的相对丰度的Pearson相关系数为0.72(95%CI：0.68～0.76)表明二者间差异有统计学意义(P<0.05)，在细菌性肺炎患者中发现了二者显著的组分相似性，Pearson相关系数为0.92(95%CI：0.88～0.95)。(2)每百万条阅读序列的总属比对没有显著差异(Wilcoxon秩和计算分析)，气管内抽吸物中位数为43.3，肺泡灌洗液为26.89，P=0.66，二者间差异无统计学意义。(3)口咽部常见微生物区系丰度无显著差异：根据Bray-Curtis差异指数(P=0.31)，没有发现微生物β-多样性在两种标本间的显著差异(P=0.31)。该研究认为，肺泡灌洗液和气管抽吸物在生物覆盖，口咽部菌群丰富度和微生物多样性方面都有相似性，与具有侵入性的肺泡灌洗液相比，在细菌性肺炎上气管内抽吸物提供了相类似的气道微生物评估。

3.3 肺泡灌洗液标本 肺泡灌洗液一直被认为是鉴定细菌的最佳生物样品[24]，导管防污染保护性灌洗可封堵远端及亚段的支气管，在一定程度上减少了污染的机会，可以提高病原菌检测的准确性。目前针对下呼吸道微生物分析大多应用肺泡灌洗液标本。He等[13]通过NGS对肺泡灌洗液标本进行检测，证实了3例重症肺炎烟曲霉菌感染。Sung等[25]通过对肺泡灌洗液标本的检测，表明NGS揭示了比培养更多样化的细菌群落，而培养则对检测某些细菌更敏感，如葡萄球菌属，梭状芽孢杆菌属和双歧杆菌属等。Dickson等[26]收集了33例肺移植患者的46例肺泡灌洗液标本，其中21例有急性肺部感染症状，25例为阴性无症状患者。46例肺泡灌洗液标本中有18例(39.1%)检出一种或多种细菌，19例(41.3%)标本中仅检测出口腔菌群。在44份(95.7%)标本中用NGS检测到细菌DNA，这一比例明显高于通过任何培养生长检测到的细菌(P<0.05)。Langelier等[27]收集22名造血干细胞移植后急性下呼吸道感染患者的肺泡灌洗液，结果：(1)7例患者(32%)经临床诊断鉴定出微生物(mNGS均检测出)，其中6例经医师认定为病原体。此外mNGS在6例常规检测阴性的患者中检测出了社区获得性肺炎常见的病原体。(2)通过对微生物的α多样性评估，发现经证实存在致病病原体患者的Simpson多样性指数(中位数，0.34[区间范围(IQR)，0.15～0.64)]，Wilcoxon秩和)显著低于未检测出或不确定致病病原体的患者(中位数，0.92[IQR，0.86～0.93]，Wilcoxon秩和)，P=0.017。(3)从分子标记数据库中筛选出与免疫反应相关的基因集，发现在确诊下呼吸道感染病原体的患者的基因集(中位数，94.9[IQR，93.8～105.6]，Wilcoxon秩和)显著大于未检测出或不确定致病病原体的患者(中位数，33.1[IQR，20.7～75.1]，Wilcoxon秩和)，P=0.022。该研究证明，与目前的微生物诊断相比，mNGS具有更强的微生物检测能力和将病原体检测与宿主反应和气道微生物同时检测相结合的能力。

3.4 刷检标本 支气管镜检查中的防污染保护性毛刷(PSB)是下呼吸道采集标本的方法之一。Grønseth等[28]收集了67例慢性阻塞性肺疾病和56例对照组的呼吸道标本，通过Illumina Miseq测序平台分析标本中的气道微生物，认为微生物多样性α指数在口腔冲洗、小容量灌洗、保护性的肺泡灌洗、保护性毛刷刷检标本中依次减少，分类群相对丰度β指数因采样方法而异，刷检标本距离矩阵分离得比小容量灌洗、保护性肺泡灌洗标本更为清楚(分别与口腔冲洗标本进行比较)。且标本采集的顺序(左侧优先或右侧优先)不影响刷检标本中的α、β指数。该研究证明，保护性的肺泡灌洗液(PBAL)、保护性毛刷刷检样品(PSB)与口咽部菌群的差异大于未受保护的，是较好的采样方法。目前防污染保护性毛刷是可以通过NGS检测病原菌、在一定程度上受污染影响较小的方法。

3.5 组织标本 肺活检组织病理学一直具有极高的准确性，而关于mNGS在肺活检组织中应用的报道仍然很少。Li等[29]选取了20例疑似肺部感染患者的CT引导下肺穿刺活检组织进行常规及NGS检测，其中培养阳性8例(包括曲霉菌、葡萄球菌、粘质沙雷氏菌、青霉菌)，12例涂片阳性(包括真菌、抗酸菌、革兰阴性杆菌)，13例组织病理学检查发现真菌及抗酸菌，15例mNGS阳性(包括细菌、真菌、结核分枝杆菌)，3例临床核酸检测阳性(结核分枝杆菌复合体)，得出结论，(1)mNGS与涂片方法相比：细菌的敏感性、特异性分别为50.0%(95% CI:2.7%～97.3%)、66.7%(95% CI:41.2%～85.6%)，真菌的敏感性、特异性分别为62.5%(95% CI:25.9%～89.8%)、66.7%(95% CI:35.4%～88.7%)，结核分枝杆菌的敏感性、特异性分别为100%(95% CI:19.8%～100%)、88.9%(95% CI:63.9%～98.1%)。(2)mNGS与培养方法相比，细菌的敏感性、特异性分别为：100%(95% CI:31.0%～100%)、76.5%(95% CI:49.8%～92.2%) 真菌的敏感性、特异性分别为57.1%(95% CI:20.2%～88.2%)、61.5%(95% CI:32.2%～84.9%)，且阳性预测值(细菌42.9%，真菌44.4%)明显低于阴性预测值(细菌100%，真菌72.7%)。(3)mNGS与组织病理学方法比较，真菌和结核分枝杆菌的特异性分别为100%、94.1%，阳性预测值分别为100%和75.0%，差异有统计学意义(P<0.01)。该研究通过mNGS在肺活检组织感染性病原体诊断中的应用，成功地识别了20例患者中的15例，证实了NGS应用于肺部组织标本感染诊断的可行性及意义。

4 NGS的判读方法

目前对于NGS如何判断致病菌尚未有一致的标准。Long等[21]认为判断致病菌需满足以下标准：首先在一个样本中识别的所有病原体必须按照每个病原体的覆盖度进行分类，得出前十位病原体(覆盖度须超过参考范围上限)，在前十位病原体中，挑选出序列数>3的病原体(序列数超过参考范围上限)，再根据疑似病原体的致病性和患者的临床症状，由高级医生确定可能的病原体及经验性治疗，出具实验室报告后，调整抗感染策略，纳入针对性治疗。这种判断方法在不同微生物覆盖度的差异、考虑免疫功能缺陷患者、特殊的致病菌时仍有待进一步讨论。朱逸敏等[30]认为抗微生物治疗对测序结果也有巨大的影响，在接受经验性治疗后的患者中，应采用更为宽松的病原体判读标准以提高阳性率，但这也将导致准确性及灵敏度的下降。Li等[29]根据以下3个条件确定来致病菌：(1)细菌或真菌属水平上>30%的相对丰度；(2)培养和(或)组织病理学检查呈阳性，并且至少从一种细菌或真菌中获得50种独特的序列片段；(3)MTBC结核至少有一个惟一序列片段。通过以上方法，在20名患者中确定了致病菌15名，但该研究样本量小，需进一步研究支持。Langelier等[27]认为致病病原体需满足：(1)临床常规检测和mNGS共同确认；(2)有文献证实其在肺部的致病性；(3)每百万阅读序列至少比在患者中发现的任何其他类型的微生物(病毒、细菌或真菌)高出2倍。微生物可认为是新的潜在病原体：(1)仅用mNGS鉴定微生物，并且符合上述标准2和3；(2)所有其他微生物都被认为是不可能的或不确定的病原体；(3)病毒PCR或细菌16S rRNA基因测序证实了上述发现，这种判读方法基于的样本量较小，且需通过PCR等方法验证，时间、成本上不利于临床应用。

总之，NGS尚未纳入下呼吸道病原微生物的常规检测，在爆发性、重症、难治性呼吸道感染方面的应用得到了一致性的认可，NGS在不同程度上提高了病毒、细菌、真菌及非典型性病原体的检出率，并具有较高的准确性，提供更多的信息。还可通过对血、痰、肺泡灌洗液、刷检、活检等标本的检测，分析病原微生物，优化临床的诊断与治疗。目前还有很多问题有待进一步研究，如各种下呼吸道标本的规范化采集方法、何种标本是检测呼吸道病原体的最优标本、致病微生物的判读“金标准”等。