体内转染黄芪来源miR-396可抑制哮喘小鼠Th2细胞的GATA-3表达①

沈朝斌 郁 兰 顾燕妮 王 嵩 陆 磊

(上海中医药大学附属上海市中西医结合医院，上海 200082)

本课题组前期研究发现，黄芪饮片煎煮后经高通量二代测序得到完整的miRNA谱系，包括黄芪所属的保守的豆科类植物miRNA谱系和非保守的黄芪特有的miRNA谱系，而非保守的黄芪miRNA谱系中最重要以及含量最多的为高表达miR-396家族[1]。因此，本研究选用miR-396合成拟似物转染了解在哮喘模型中对辅助性T细胞的调节作用。黄芪为豆科多年生草本植物的根茎(Astragalus membranaceus.Fisch.)，中医认为黄芪具有补气升阳和益卫固表等功效，用于肺气虚、表虚自汗和气虚外感等证，是最常用的中药材之一，常配白术、防风(玉屏风散，黄芪作为君药)用于儿童支气管哮喘缓解期和反复呼吸道感染。先前研究表明，玉屏风散对哮喘小鼠模型具有抑制Th2和Th17细胞炎症因子的作用[2,3]。目前尚无植物miR-396转染哺乳动物的报道。为进一步明确中药治疗哮喘的免疫调节作用机制，本研究通过经鼻滴注miR-396合成拟似物(mimic)(agomir)，观察小鼠哮喘模型转染后miR-396表达及哮喘相关免疫指标，试图诠释黄芪中的miR-396基本药理作用。

1 材料与方法

1.1材料 健康雄性BALB/c小鼠40只，8周龄，体质量(22.38±0.79)g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。动物饲养于长海医院动物实验中心SPF级实验室(许可证：SYXK[沪]2015-2017)，自由摄取高温灭菌后的饲料及饮用水，饲养1周后开始实验。按随机数字表法将小鼠分为对照组、哮喘模型组、miR-396转染组、地塞米松治疗组，每组10只。小鼠IL-5、IL-13、IL-17A、TGF-β和IFN-γ定量酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自美国Bioscience公司，miR-396 mimics(agomir)由上海吉玛基因股份有限公司合成，TRIzol 试剂购自美国Invitrogen 公司，氯仿、异丙醇及无水乙醇等均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1哮喘小鼠模型制备 模型组：在第0(实验当天)、7、14天分别予1% OVA混悬液腹腔注射0.2 ml致敏3次，第21、23、25天以0.4% OVA溶液滴鼻激发3次，间隔2周后，第39、41、43天予0.4% OVA溶液滴鼻再次激发3次。空白组：同样时间和方式以生理盐水代替OVA混悬液(溶液)及药物分别进行腹腔注射及滴鼻。

miR-396转染组：致敏、激发阶段的方法同模型组，OVA再次激发30 min后(第39天起)，将20 μg miR-396 agomir(无核酶水溶解后浓度为5 μg/μl)加入到0.9% 氯化钠溶液中配置成5 ml 转染溶液，每只小鼠经鼻滴入200 ng，隔日一次，连续7次。地塞米松组：致敏、激发阶段的方法同模型组，OVA再次激发30 min后(第39天起)，腹腔注射地塞米松0.2 ml(5 mg/ml)治疗，隔日一次，连续7次。

1.2.2肺匀浆的收集和组织标本保存 小鼠末次治疗7 d后(第58天)予苯巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，取完整左肺，4℃生理盐水3 ml研磨，回收肺匀浆约1.5 ml/小鼠，即放入-20℃冷藏，2 h后置-80℃冻存，待测相关细胞因子。

1.2.3组织miR-396 表达的测定 分别取小鼠肺匀浆0.5 ml、脾脏0.5 g和外周血0.5 ml，以1∶9 容积加入TRIzol溶液，提取完整总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 质量，紫外分光光度计测定总RNA 浓度。miR-396反转录采用TaqMan miRNA 反转录试剂盒和特异miRNA 茎环引物，反应条件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。miR-396 实时聚合酶链反应(PCR)采用TaqMan miRNA 检测试剂盒，反应条件：95℃ 10 min，40 个扩增循环(95℃ 15 s，60℃ 60 s)。在ABI 7500 定量 PCR 仪上扩增和检测。选取U6 snRNA 作为内参。

1.2.4ELISA检测细胞因子的表达 取小鼠肺匀浆1 ml，2 700 g离心5 min，上清液-4℃保存待测。对肺匀浆先进行蛋白定量测试，浓度相对标准化处理。采用小鼠ELISA试剂盒，根据Bioscience公司操作说明书步骤，并通过OD值计算IFN-γ、IL-5、IL-13、IL-17A及TGF-β的浓度。

1.2.5qRT-PCR检测Th细胞转录因子mRNA的表达 脾脏组织按照Trizol说明书提取总RNA，逆转录cDNA，实时定量PCR扩增均由上海基尔顿基因公司完成，引物设计合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成(表1)。选取GAPDH作为内参。

1.2.6肺部病理检查 取完整右肺组织，用4%多聚甲醛溶液固定，脱水石蜡包埋制备石蜡切片，脱蜡后使用苏木素-伊红(HE)染色，中性树胶封片，光镜下观察病理学改变。

表1 辅助性T细胞主要转录因子RT-PCR扩增引物

Tab.1 Specific PCR primers for amplifying in master transcription factors of T helper cells

Transcription factorsSequence(5'→3')T-betsenseCAACAACCCCTTTGCCAAAGantisenseTCCCCCAAGCAGTTGACAGTGATA-3senseGAGGTGGACGTACTTTTTAACATCGantisenseGGCATACCTGGCTCCCGTSTAT-6senseTGAGGTGGGGACCAGCCGGantisenseTGAGGAAACCAGGCATCCTGAACTROR-γtsenseGTGACCAGGACACACAGCGGantisenseTGAGGAAACCAGGCATCCTGAACTFoxp-3senseTGTGTGGTTGTTGGCATTGTAGGCantisenseCTGTGACCATCCCCTCATCT

2 结果

2.1转染miR-396 后小鼠肺脏、脾脏和外周血miR-396 表达结果 miRNA-396转染表达以脾脏为最高，表达量为U6内参的(13.87±2.05)倍；外周血次之，表达量为(12.62±1.65)倍；肺部表达为(10.69±1.27)倍(图1)。

2.2转染miR-396对哮喘小鼠肺匀浆中细胞因子水平的影响 哮喘模型组IFN-γ和TGF-β水平较对照组显著下降(P<0.05)，而IL-5、IL-13和IL-17A水平显著增高(P<0.05)。miR-396转染组均能显著纠正各细胞因子改变，以IL-5、IL-13、IL-17A和TGF-β最为显著(P<0.001)。转染组IFN-γ与哮喘模型组比较差异有统计学意义(14.99±2.15 vs 19.81±6.01，P值为0.018，P<0.05)；转染组与地塞米松治疗组比较，在提高IFN-γ水平方面差异无统计学意义(19.81±6.01 vs 25.65±6.32，P值为0.079，P>0.05)。转染miR-396可显著抑制哮喘IL-5和IL-13水平(分别为52.26±4.19 vs 74.23±7.53、16.11±4.86 vs 30.81±3.16，均P<0.001)；其抑制作用优于地塞米松治疗组(52.26±4.19 vs 66.42±6.74和16.11±4.86 vs 27.33±5.39，均P<0.01)。转染组IL-17A显著低于哮喘模型组(39.25±4.37 vs 94.43±9.46，均P<0.001)，但对IL-17A的抑制作用显著低于地塞米松治疗组(39.25±4.37 vs 30.06±3.37，P<0.001)。转染miR-396可显著提高哮喘模型组TGF-β水平(43.74±10.14 vs 20.71±3.63，P<0.001)，但作用显著低于地塞米松(43.74±10.14 vs 97.11±16.44，P<0.001)，差异有统计学意义(表2和图2)。

图1 miR-396转染后小鼠肺脏、脾脏和外周血miR-396 表达Fig.1 Quantitation of miR-396 mimic detectable by PCR in different tissues of lung,peripheral blood and spleen of transfected miceNote:Expression levels of the miR-396 were normalized to level of U6 as a control miRNA using the 2-ΔΔCt method(fold).

表2 转染miR-396对哮喘小鼠肺匀浆中细胞因子水平的影响

Tab.2 Effect of miR-396 mimic on expression levels of various cytokines by T helper cells in pulmonary homogenates

Cytokines(ng/ml)Control group(n=10)Asthma model group(n=10)Transfect group(n=10)Dexamathasone group(n=9)IFN-γ25.60±5.4514.99±2.1519.81±6.011)25.65±6.322)IL-556.18±6.4774.23±7.5352.26±4.193)66.42±6.741)IL-1320.99±5.9030.81±3.1616.11±4.863)27.33±5.392)IL-17A63.43±15.8194.43±9.4639.25±4.373)30.06±3.373)TGF-β128.00±17.5320.71±3.6343.74±10.143)97.11±16.443)

Note：The levels of Th cytokines were measured by ELISA.1)P<0.05,2)P<0.01,3)P<0.001,compared with the asthma model group.

图2 转染miR-396对哮喘小鼠肺匀浆中细胞因子水平的影响Fig.2 Effect of miR-396 mimic on expression levels of various cytokines by T helper cells in pulmonary homogenatesNote:The levels of Th1 cytokine(IFN-γ),Th2 cytokines(IL-5 and IL-13),Th17 cytokine(IL-17A),and Treg cytokine(TGF-β)were measured by ELISA.

表3 转染miR-396对哮喘小鼠脾脏Th细胞mRNA的影响(2-ΔΔCt值)

Tab.3 Transfect miR-396 mimic on expression of transcription factors mRNA of helper T cells in spleen(2-ΔΔCt)

GroupsFoxp-3T-betROR-γtSTAT-6GATA-3Control11111Asthma model0.10±0.030.15±0.0236.35±1.674.57±0.6712.36±1.03miR-396 mimics0.22±0.040.25±0.028.40±1.743)3.71±0.234.46±0.433)Dexamethasone0.58±0.071)0.63±0.031)3.74±0.893)1.44±0.122)7.06±0.693)

Note：The each mRNA level of transcription factor compared with the control group(is conventionally set to be 1 fold).Total RNAs were extracted from spleen tissues and the levels of mRNAs were determined via RT-PCR.GAPDH served as an internal control.The comparative Ct method(2-ΔΔCt)was used to quantify gene expression levels.1)P<0.05,2)P<0.01,3)P<0.001,compared with the asthma group.

图3 转染miR-396对哮喘小鼠脾脏Th细胞mRNA的影响Fig.3 Effects of transfect miR-396 inhibition on expression mRNA levels of master transcription factors asso-ciated with T cells in spleen of mice asthma modelNote:Total RNAs were extracted from spleen tissues and the levels of mRNAs were determined via RT-PCR.GAPDH served as an internal control.The comparative Ct method(2-ΔΔCt)was used to quantify gene expression levels.

图4 miR-396 表达对哮喘小鼠肺部病理的影响Fig.4 Inhibition of airway inflammation in a OVA allergen model mice of asthma by miR-396 mimicNote:Representative photomicrographs of HE-stained lung sections from mice of asthma model(A,B)and transfect miR-396(C,D)groups are shown.

2.3转染miR-396对哮喘小鼠Th细胞mRNA的影响 哮喘模型组Th细胞相关转录因子与对照组表达比较：Th1细胞的T-bet降低；Th2细胞的STAT-6显著增高，GATA-3显著增高；Th17细胞的ROR-γt 显著增高；Treg细胞转录因子Foxp3降低。miR-396转染后Th细胞转录因子mRNA与哮喘组比较，表达结果比较：Th1细胞的T-bet表达增高0.66倍；Th2细胞的STAT-6表达下降；GATA-3表达显著降低；Th17细胞的ROR-γt表达显著降低；Treg细胞转录因子Foxp3表达显著增高。地塞米松治疗组Th细胞相关转录因子与哮喘组比较，Th1细胞的T-bet 表达显著增高；Th2细胞的STAT-6表达显著降低，GATA-3表达降低；Th17细胞的ROR-γt 表达显著降低；Treg细胞转录因子Foxp3表达显著增高。结果提示：miR-396转染最主要的作用是抑制和降低Th2细胞GATA-3的表达；miR-396转染后对抑制哮喘Th2细胞主要转录因子GATA-3的表达的作用优于地塞米松治疗组，但在降低Th2细胞STAT-6和Th17细胞ROR-γt的表达以及提高Th1细胞T-bet和Treg细胞Foxp3的表达方面，地塞米松的作用似乎优于转染miR-396(表3和图3)。

2.4转染miR-396 对哮喘小鼠肺部病理的影响 经OVA诱导的BALB/c小鼠哮喘模型肺部病理可见支气管呈复层鳞状上皮细胞改变，排列紊乱，顶浆分泌多见，间质见大量炎症细胞浸润，伴充血，肺泡显著减少，大量肺泡结构消失(见图4A、B)。经miR-396转染后，肺部病理切片可见支气管上皮细胞排列规则，仍见顶浆分泌，部分间质可见充血，黏膜下炎症细胞浸润显著减少，肺泡结构大部分恢复，结构清晰(见图4C、D)。

3 讨论

本次实验采用了经热力学处理的(煎煮后)黄芪中高表达miR-396家族合成拟似物(mimic)作为哮喘治疗的生物制剂，并与肾上腺皮质激素(标准)治疗对照。

小干扰性RNA(small/short interfering RNA,siRNA)是一类18～25个核苷酸长度的双链RNA分子，其主要在RNA干扰(RNAi)通路中起干扰特异基因表达的作用。基因抑制的有效性很大程度上取决于目的基因序列的选择。根据本课题组前期研究的黄芪miRNA谱系分析，选择黄芪高表达非保守特征性的miR-396家族序列，采用了体外合成拟似物，并与人和小鼠的基因组数据库(BLAST)进行比较，排除了其他编码序列/表达序列标签(Expressed sequence tags,ESTs)同源的序列干扰。通过转染siRNA导致功能性基因沉默是一种成熟的治疗各种基因异常疾病的策略，在细胞浆中，双链siRNA介导形成RNA诱导的静默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)特异性降解靶向mRNA，从而抑制目标蛋白合成[4,5]。

植物外源性的miRNA能否进入哺乳动物体内并持续表达是有争议的，以往认为外源性miRNA在哺乳动物的外周血和组织中是高度不稳定的，但近十年的研究证明，外源性miRNA可以经受极端pH值和耐受核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)的活性，并稳定存在于哺乳动物外周血中[6-8]。也有研究开创性地提出，病毒和草药等来源的miRNA可能可以跨越物种(cross-kingdom)而起作用[9-12]。本研究结果表明，miR-396拟似物可以进入小鼠体内，并高表达在脾脏、外周血和肺部。因miR-396为黄芪来源的植物性外源性特征性miRNA，在哺乳动物体内并不存在，所以在PCR检测中无需与空白对照组比较，仅需与内参基因相对照，小鼠组织中表达的植物miRNA结果应该是可靠和可信的。

玉屏风散是目前我国推荐治疗儿童哮喘的中成药[13,14]，其配伍组方中的君药为黄芪。该经方在我们先前的研究中也被反复证实了对哮喘小鼠有显著的免疫调节作用，尤其是对Th2细胞所分泌的Ⅱ类炎症因子具有抑制作用[2,3]；2008年我们发现，玉屏风散对OVA诱导的哮喘小鼠所导致的Th17细胞分泌的IL-17也有很好的抑制作用[15]；不仅如此，在哮喘小鼠使用玉屏风散治疗后，与免疫相关的miRNA也发生了变化[16]。为此，我们对热力学处理后(经煎煮后)玉屏风散及各味饮片进行高通量二代测序(High throughput next generation sequence, NGS)，得到各组分的miRNA谱系，尤其对方剂组成中的君药黄芪进行生物信息学分析，得到非保守高表达的miR-396家族[1]。

哮喘免疫异常主要为Th1/Th2细胞的失衡，尤其是Th2细胞所分泌的IL-5和IL-13显著增高所导致的嗜酸性粒细胞浸润和血清IgE合成增加；最近研究认为炎症因子和外周血的这些指标也是哮喘治疗疗效判断的重要依据[17]。本次实验主要是将miR-396拟似物转染至哮喘小鼠，结果表明它对Ⅱ类炎症细胞因子的有很好的抑制作用，尤其对IL-5和IL-13的抑制作用优于地塞米松；虽然miR-396拟似物转染对IL-17的抑制以及对IFN-γ和TGF-β的提升均存在高度显著性差异，但其作用均弱于地塞米松治疗组。同时，本次研究对辅助性T细胞的主要转录因子mRNA检测结果与细胞因子变化水平基本吻合。转染miR-396组小鼠Th2细胞GATA-3 mRNA表达较哮喘模型组显著下降；而Th17细胞的ROR-γt mRNA 表达显著降低；转染miR-396组GATA-3 mRNA的抑制程度优于地塞米松治疗组，而对ROR-γt mRNA 表达抑制程度低于地塞米松组。miR-396转染对T-bet、STAT-6和Foxp-3 mRNA表达均无显著作用，而地塞米松治疗组既能提高哮喘小鼠Th1细胞T-bet和Treg细胞TGF-β的mRNA表达，同时对Th2细胞的STAT-6的mRNA表达也有显著的抑制作用。本次实验的结果提示，地塞米松对哮喘的免疫调节是较为全面的，仅仅单个miRNA拟似物不能全面逆转哮喘的免疫病理状况；反之，如果中药单味药或组方，即植物miRNA完整谱系的给予可能具有更好的全面的免疫调节作用，这可能解释了本课题组前期研究的结果[2,3]。经转染miR-396的哮喘小鼠肺部病理也能观察到黏膜下炎症细胞浸润和充血显著减少，肺泡重新开放，支气管和小支气管上皮细胞排列规整程度改善，也证明了miR-396拟似物对哮喘小鼠具有一定的免疫调节作用。

本次实验首次证明了经热力学处理后的中药miRNA是可以在小鼠体内表达的，也说明了煎煮后的草药所含有的植物来源的miRNA可能是具有药理作用的活性物质。换而言之，植物药中除次生代谢产物外(如黄芪中含有黄酮类和皂甙类物质等)，小分子的miRNA可能是另一类重要的活性成分，有望成为RNAi新的生物制剂，同时也为类似的植物药机制研究提供了一种新的方法[18]。黄芪中新的非保守和高表达的miR-396家族转染在哮喘小鼠具有显著的免疫调节作用，其可能机制为抑制Th2细胞的GATA-3表达从而减少IL-5和IL-13产生，缓解哮喘的炎症病理状况。

植物来源的miRNA转染的剂量效应依赖关系、在体内的表达持续时间以及RISC形成的具体作用部位有待进一步的深入研究去证明。另一方面，miR-396家族核苷酸序列在人类具有潜在的多个可能的靶基因作用位点，包括：cAMP调节磷蛋白异构体19(cAMP-regulated phosphoprotein 19 isoform)、DNA结合蛋白RFX7(DNA-binding protein RFX7)和钾/钠超极化环核苷肽通道1(Potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel)等73个相匹配的基因位点(http//:www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)，转染miR-396在体内的作用过程可能十分复杂。

某种程度上，黄芪煎煮液提取的高度保守高表达的12种Ⅰ类miRNA分子，同时也发现了9个非保守高表达的黄芪特有的miRNA分子，除miR-166i和miR-5077外，7个属miR-396家族成员，从理论上均具有潜在的RNAi作用，用单一合成miRNA拟似物转染实验的意义可能仅仅是在植物药治病的免疫调节基础理论上获取一些现代医学的证据，但深入研究剂量依赖(涉及中药服用持续时间)和明确靶基因干扰作用部位可能对植物药今后的研究具有方法学上的探索意义。