富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白基因敲除动物模型在腰椎间盘退变所致下腰痛研究中的应用*

马云龙 宋春雨 综述 刘晓光 祝 斌 审校

(北京大学第三医院疼痛科，北京 100191)

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IVDD)是一种由遗传因素、机械因素及环境因素等共同导致椎间盘(intervertebral disc，IVD)细胞衰老及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成与分解代谢失衡的过程，常与下腰痛(low back pain，LBP)及其伴随出现的精神睡眠障碍密切相关[1,2]。动物模型的建立为深入理解IVDD的发生与进展，探索延缓IVDD及其相关的机体功能障碍等研究提供了可能。虽然已有多种动物模型用于IVDD和LBP的实验研究，但多数为侵袭性建模方法，可能对实验动物产生较大创伤并干扰实验结果的评价与解释，有关IVDD所致LBP的功能学研究报道也较少[3，4]。此外，这些模型均无法良好地模拟人类IVD自发性退变并产生LBP的渐进性特征。富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)基因敲除的小鼠(SPARC-null)可缓慢地发生IVDD和LBP，产生类似于人类IVDD所致LBP的自发性与渐进性过程[5，6]，而且建模过程并不会对实验动物产生过多伤害，可能是研究IVDD与LBP相互关系的一种理想动物模型。本文对SPARC基因敲除的小鼠模型在IVDD所致LBP研究中的应用进行文献总结。

1 SPARC在IVDD和LBP中的潜在作用

SPARC又被称为骨连接蛋白或基底膜蛋白40，主要表达于骨、肠黏膜、愈合伤口等组织中。人类SPARC由一个坐落于5q31～q33染色体的25.6kb长单基因编码，包含10个外显子和9个内含子，基因结构包括四部分：氨基末端包含大容量低亲和的钙结合域，一个富含半胱氨酸结构域，一个亲水结构域和羧基末端包含与胶原结合的细胞外钙离子域[7]。SPARC的表达与基质蛋白(如胶原蛋白)关系密切，后者是ECM的主要结构成分并参与维持ECM的机械稳定性。SPARC通过分子结构中氨基和羧基末端结构域直接与结构基质蛋白结合来影响前胶原加工及胶原纤维的形成、沉积和重塑过程[8～10]，还可调节多种细胞因子和基质金属蛋白酶的表达[11，12]，从而干扰 ECM内环境中的合成与分解代谢平衡，最终影响细胞与ECM的相互作用和ECM的重塑。鉴于此，已有大量研究报道SPARC在调节骨矿物组织与软骨组织代谢、线粒体功能变化、皮肤弹性改变、眼压调节及细胞黏附与迁移等多种病生理过程中的重要作用[13～17]。此外，SPARC在多种恶性肿瘤、结缔组织疾病、早期白内障形成、青光眼、糖尿病相关病变、成骨不全症、心肌与骨骼肌疾病及伤口愈合不良等多种疾病的发生发展和治疗方面也扮演着重要角色[8,12,14,15,18～21]。

IVD由纤维环(annulus fibrosus，AF)、髓核(nucleus pulposus，NP)和软骨终板3部分组成，作为脊柱的重要组成结构参与脊柱纵向屈伸、侧向弯曲和旋转等活动；组织学上，IVD由间盘固有细胞、胶原蛋白(Ⅰ～Ⅴ和Ⅹ～Ⅻ型胶原)及蛋白多糖等基质蛋白为主的ECM组成[22]。IVDD是椎间盘突出症、椎管狭窄症、脊柱不稳定等脊柱相关疾病的重要病理基础，其病理学改变主要表现为活跃细胞数量减少、参与ECM合成与组装的基质蛋白含量减少和分布变化、参与ECM降解的多种基质蛋白酶表达增高、细胞表型改变以及炎症反应等[23]。目前，腰椎IVDD被认为是慢性轴性和(或)根性LBP的主要影响因素[1，24]。IVDD引起LBP可能机制包括脊柱不稳对椎小关节、椎旁肌肉和韧带的刺激，IVD细胞分泌促炎因子增加及免疫细胞局部浸润和激活所致炎症级联反应的放大，伤害刺激诱导IVD内新生血管及神经纤维支配的增加，以及持续伤害刺激对脊髓或髓上结构和功能的敏化等[25,26]。

Gruber等[27]2004年首次报道SPARC在人类IVD组织中表达的证据，他们选取各年龄层(新生儿至老年人群)接受手术患者的IVD组织进行免疫组学研究，结果显示新生儿至0.19岁龄的IVD中，SPARC在所有AF外环细胞中均有阳性表达，在NP和AF内环细胞中阳性表达率较低，分别为76.0%和76.4%；与此相比，4.7～76岁龄的AF细胞中，SPARC的总体阳性表达率为66.7%(P=0.04)。随后，该团队进一步研究显示靶向敲除SPARC基因的小鼠在14、19和20个月时表现出间盘退化表型，组织学观察显示，正常对照小鼠的AF组织中胶原纤维直径均匀、纤维边缘规则，SPARC基因敲除小鼠AF组织中胶原纤维的大小和直径范围广泛、边缘不规则[5]。此外，Tajerian等[28]研究显示，IVD所致LBP表型的小鼠和人类均存在SPARC启动子甲基化增加的情况，为直接确定SPARC启动子区甲基化对基因启动子活性的影响，将启动子区域亚克隆至荧光素酶报告质粒中，比较甲基化或模拟甲基化质粒转染至人胚肾HEK293细胞内荧光素酶活性变化，结果显示甲基化或模拟甲基化处理的细胞内荧光素酶相对活性较未处理组显著降低(P<0.01)，提示SPARC启动子区甲基化可沉默基因启动子活性，这些结果表明SPARC启动子甲基化所致SPARC蛋白失活在人类和动物IVDD和LBP中具有潜在作用。

2 SPARC-null小鼠模型建模方法及表征特点

20世纪80年代，Norose等[20]率先确立SPARC-null小鼠模型的传统建模方法。通过分离129SV小鼠的SPARC基因中含外显子2～5的BamHI片段构建靶向载体，于外显子4起始端插入2个新霉素耐药基因表达盒，将pMC1单纯疱疹病毒胸苷激酶构建体克隆至基因组片段的3’端生成构建体，并转染至CCE胚胎干细胞；在条件培养基中将转染的细胞培养在G418耐药STO胚胎成纤维细胞上，筛选耐药菌落并分离DNA，并应用Southernblot鉴定靶基因敲除的细胞；应用Nsil消化基因组DNA产生野生型和突变型等位基因，将携带SPARC基因敲除的胚胎干细胞注射至C57BL/6J小鼠的胚泡期胚胎以产生嵌合体；将含嵌合体的雄性小鼠与雌性C57BL/6J小鼠回交产生第1代(F1)杂合子小鼠(SPARC+/-)，再将F1小鼠(SPARC +/-)继续回交以产生第2代(F2)纯合子基因突变型(SPARC-/-)和野生型(SPARC +/+)小鼠；连续回交10代以上获得基因高度同源的纯合突变型小鼠，该小鼠既不产生SPARC的mRNA，也不产生相应蛋白[20]。

靶向敲除SPARC基因能够加速年龄依赖性IVDD的发生，同时伴随出现年龄依赖性的慢性LBP行为特征，主要表现为轴性腰痛、放射性下肢痛和运动障碍[5,6,29]。针对SPARC-null小鼠对疼痛刺激的反应特点进行分类评估，该模型小鼠表现出对冷刺激和脊柱轴向拉伸引起的疼痛高度敏感，而对机械性或热刺激不敏感[28]。该模型对刺激的敏感性存在位点特异性，小鼠的后爪和背部对冷刺激敏感性显著高于尾部[6,30]。Millecamps等[30]进行的一项横断面、多队列、行为学和组织学研究探讨LBP与腰椎IVD退变程度之间的关系，研究选取6～78周龄SPARC-null和野生型对照小鼠，评估IVD退变程度、轴性疼痛及放射疼痛等行为体征。SPARC-null小鼠在18、24、36周相比于同周龄对照小鼠，对轴向拉伸刺激以及后爪对冷刺激耐受性均呈显著降低趋势(轴向拉伸耐受性对比：3个周龄组P均<0.001；后爪对冷刺激耐受性对比：3个周龄组P均<0.01)；虽然对照组和SPARC-null组小鼠间盘退变评分随年龄增长均逐渐增高，但直到78周龄，SPARC-null组间盘退变评分显著高于对照组(P<0.001)，提示SPARC-null组小鼠间盘退变程度更加严重。这些结果表明，SPARC-null小鼠IVD退变程度呈现年龄依赖性增加。与此同时，2组小鼠对轴向拉伸的耐受性与IVD退变程度相关，但后爪对冷刺激的耐受性与IVD退变程度并不相关。36周龄以内的SPARC-null小鼠相比年龄匹配的对照组小鼠，对轴向拉伸的耐受性较差，但54周龄2组小鼠对轴向拉伸的敏感性无明显差别(P>0.05)；后爪对冷刺激敏感性在18周龄的SPARC-null小鼠中出现显著升高(P<0.01)，而且随年龄的增长而持续增加。Miyagi等[31]选取不同年龄层小鼠研究慢性IVD所致LBP的潜在分子机制；通过检测后爪皮肤对冷、热和机械刺激的敏感性以评价放射性疼痛；应用握力实验和悬尾实验以评估轴向LBP；免疫组化检测神经纤维标记物PGP 9.5和感觉神经肽降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)以识别IVD神经支配；定量分析背根神经节中CGRP和神经肽Y的免疫反应活性以及脊髓背角神经元中的CGRP和星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和小胶质细胞标记物离子钙接头蛋白-1的免疫反应活性，以评估感觉神经系统的可塑性。结果显示SPARC-null小鼠表现出对冷刺激敏感、轴向疼痛不适、IVD内和IVD周围感觉神经支配的年龄依赖性增加、背根神经节中CGRP和神经肽Y的年龄依赖性上调、脊髓背角神经元中降钙素基因相关肽、GFAP和离子钙接头蛋白-1的年龄依赖性增加。这些结果表明，退化IVD中感觉神经纤维支配增加、背根神经节和脊髓背角神经元的神经可塑性可能是慢性椎间盘源性LBP的病理生物学基础。

3 SPARC-null小鼠模型在IVDD与LBP行为学评价中的应用

IVDD和慢性LBP常引起多裂肌内的炎症反应和(或)结构重塑过程，近期学者应用SPARC-null模型探讨IVDD和慢性LBP与腰椎多裂肌内炎症信号和结构蛋白变化的相互作用关系。James等[32]的一项纵向病例对照研究探讨自发性IVDD对多裂肌内炎症信号活性的影响及后者与IVDD进展和严重程度的相关性，同时评估运动或锻炼在此发挥的预防作用。研究选取SPARC-null小鼠和对照小鼠并分为静止组和运动组，在小鼠9个月大时对2组进行核磁扫描以确定IVDD，并从L2～6节段获取多裂肌肌肉片段并检测炎症相关指标。结果显示，SPARC-null小鼠与野生型对照组小鼠相比，多裂肌内促炎因子IL-1β(P<0.0001)、IL-6(P=0.012)、TGF-β1(P=0.009)和脂联素(P<0.0001)表达显著增高，其中IL-1β的表达水平与IVDD严重程度显著相关(P<0.0001)，运动后能够下调多个促炎因子的表达水平。这些结果表明IVDD能够增强多裂肌内炎症反应，与IVDD的严重程度密切相关；运动本身能够通过降低多裂肌内的炎症因子并延缓IVDD进展。该团队后续进一步研究显示，SPARC-null小鼠的L1～2和L3～4节段分别呈现重度和轻度IVDD，对这两节段多裂肌样本进行检测显示，重度IVDD节段的多裂肌内结缔组织厚度增加，胶原蛋白Ⅲ(P=0.02)、纤维连接蛋白(P=0.03)、结缔组织生长因子(P<0.0001)、P物质(P<0.05)及金属蛋白酶组织抑制剂-1(P=0.02)和金属蛋白酶组织抑制剂-2(P=0.03)表达水平显著增高；然而，运动组小鼠结缔组织厚度呈现缩小趋势，且前述参与形成多裂肌纤维网络的相关蛋白表达也出现下调。这些结果表明，慢性IVDD能够促进多裂肌内部纤维化结构改变，运动同样可以改善这些结构重塑过程，改善IVDD的进展及与其相关的LBP[33]。

此外，多项研究也在SPARC-null动物模型上评价部分镇痛药物对IVDD所致轴性疼痛和放射性疼痛的改善作用。Millecamps等[29]对6月龄SPARC-null小鼠和野生型小鼠(对照组)经腹腔注射阿片类药物吗啡(6mg/kg)，药物作用至90min时SPARC-null小鼠后爪皮肤对冷刺激的敏感性较对照组显著降低(P<0.05)。同样，Tajerian等[34]在此模型上评价吗啡和α2肾上腺素能受体激动剂可乐定联合应用对轴性疼痛和放射性疼痛的影响，结果显示吗啡∶可乐定(100∶1)联合应用不仅在改善轴性疼痛方面表现出协同效应，还可改善放射性疼痛的治疗窗。Krock等[35]应用此模型研究抑制Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)对延缓IVDD及改善LBP行为学特征的影响，研究选取7～9月龄雄性SPARC-null和野生型对照小鼠，应用TLR4抑制剂TAK242连续治疗8周，每周分别应用握力试验和丙酮试验评估轴向疼痛和放射性疼痛，治疗结束后检测脊髓内和腰椎IVD的组织细胞学改变以及相关蛋白表达变化。结果显示，与野生型对照小鼠相比，SPARC-null小鼠的轴性疼痛(P<0.01)和放射性疼痛(P<0.01)阈值基态水平较低，；慢性抑制TLR4能够降低SPARC-null的上述疼痛表征。分子水平分析显示，SPARC-null小鼠与对照组相比脊髓背角神经元中CGRP和GFAP表达明显增加(P<0.05)，但TLR4抑制剂处理SPARC-null组小鼠后两者均出现显著减少(药物处理组与药物未处理组对比：CGRP水平P<0.05；GFAP水平P<0.01)；SPARC-null小鼠IVD组织较对照组小鼠分泌较高水平促炎因子(SPARC-null组与对照组小鼠对比：IL-1α水平P<0.01；IL-1β水平P<0.05)，模型小鼠中的这些因子经TLR4抑制剂处理后较药物未处理组均显著降低(药物处理组与药物未处理组对比：IL-1α水平P<0.01；IL-1β水平P<0.05)。这些结果表明，慢性抑制TLR4可降低SPARC-null小鼠LBP、疼痛相关神经可塑性和IVD的炎症反应。

4 SPARC-null小鼠模型的其他表型

虽然SPARC-null小鼠在IVDD和LBP的研究应用具有一定优势，但由于SPARC也参与调节机体多种病生理过程的调节，因此，存在其他表型特征。1月龄SPARC-null小鼠表现出皮肤胶原纤维直径减少、皮肤抗拉强度降低，这可能影响皮肤对疼痛刺激的敏感性，从而干扰疼痛行为学检测结果的准确性[15]。SPARC-null小鼠可能还有成骨不全表现，SPARC基因单核苷酸多态性所致SPARC表达缺失，可能致使小鼠骨矿化基质减少，随年龄的增长骨小梁体积减少、总骨形成率降低从而出现成骨不全[36]，而且SPARC的误义突变也可导致隐性成骨不全[19]。此外，SPARC缺乏可致B型淋巴细胞增殖受损，从而影响机体正常骨髓基质功能[37]。

5 小结

不可否认，既往动物模型在研究IVDD或LBP单一方面有良好的应用价值，但大多数需对间盘和(或)神经进行物理性或化学性损伤，无法良好模拟IVD的自然退变与LBP功能障碍之间的相互作用与内在联系。SPARC-null小鼠模型基于SPARC基因敲除所致贯穿动物整个生命周期的一个缓慢性、年龄依赖性及自发性IVDD和LBP所建立，其相比以往模型能更准确地模拟与评估人类中IVDD退变与功能障碍的动态演变过程，已逐步应用于IVDD所致LBP的解剖学和疼痛行为学等相关研究。国内学者应用该模型的研究报告尚缺乏，可能与该动物模型建模时间和经济成本高(回交代数多、时间至少2年)有关，导致模型的获取有一定难度。合理选择优化的基因编辑技术对该模型进行改良可能一定程度上降低建模的时间和经济成本，便于国内外学者的广泛应用和研究。此外，因SPARC基因的多重功能，对其进行靶向敲除产生的其他表型可能干扰研究结果的判读，需要对相关实验结果进行合理的分析与解释。