蜜蜂肠道微生物研究进展

李家豪，冯启理，韩日畴

(1. 华南师范大学生命科学学院，广州 510631；2. 广东省科学院动物研究所，广东省动物保护与资源利用重点实验室， 广东省野生动物保护与利用公共实验室，广州 510260)

蜜蜂作为一种经济昆虫，不仅酿造造福人类的蜜蜂产品，更为许多经济作物传粉，具有重要的经济、生态价值(Gallaietal., 2009; Hroncovaetal., 2019)。全球蜜蜂数量的变化显著影响经济作物的产量和生态环境植被。动物肠道中的微生物群落可以帮助消化食物、解毒有害物质、提供必要的营养、防止病原体和寄生虫入侵，调节发育和免疫，从而使宿主受益(Hamdietal., 2011)。可见微生物群与宿主的健康息息相关。当宿主体内的微生物群遭遇到某种因素的压力，菌群会失调，并导致宿主生理功能无法正常运行，甚至死亡。许多西方国家遇到一种授粉危机，各地出现了大规模蜜蜂的不明原因死亡，称为蜂群衰竭失调(Colony Collapse Disorder, CCD) (Genersch, 2010)。研究人员调查蜜蜂死亡的原因，发现这个现象可能是在环境压力、蜜蜂饲料(花蜜和花粉)缺乏以及生物压力协同作用下导致的(Khanetal., 2020)。此外，蜜蜂的肠道微生物菌群研究也是一个良好的模型。本文主要综述了蜜蜂肠道菌群的组成、作用、影响因素以及研究方法，提出了存在的问题以及对未来研究的展望。

1 蜜蜂肠道菌群构成与特征

1.1 蜜蜂核心菌群及特征

蜜蜂体内存在大量的微生物，尤其是肠道体内的微生物与蜜蜂的生理活动密切相关，参与了花粉等物质的消化吸收，同时提高蜜蜂对病毒虫害的抵抗能力(Cariveauetal., 2014)。目前研究人员通过传统分离培养和16S r DNA 结合的方法发现在蜜蜂肠道存在5种核心菌群和4种含量相对较少的菌群(Donaldsonetal., 2016)。5种核心菌种包括2种革兰氏阴性菌Snodgrassellaalvi(β-变形菌纲)和Gilliamellaapicola(γ-变形菌纲)(Kwongetal., 2013)，2个革兰氏阳性的乳杆菌属类群LactobacillusFirm-4、Firm-5 (Babendreieretal., 2007)以及双歧杆菌Bifidobacterium(Bottacinietal., 2012)。其余的4个菌种Frischellaperrara，巴尔通体菌Bartonellaapis,Parasaccharibacterapium和葡糖杆菌Gluconobacter中特定的一个种类群“Alpha 2.1”虽然不会稳定大量地存在蜜蜂肠道中，但最近也证明了它们在肠道有严格的生态位(李晨伊等，2018)。

共生菌主要归为九大类，分别是：Gamma-1(Gilliamellaapicola)、Gamma-2(Frischellaperrara)、Beta(Snodgrassellaalvi)、Alpha-1(Bartonellaapis)、Alpha-2.1、Alpha-2.2(Parasaccharibacterapium)、Bifidobacterium、Firm-4和Firm-5(Jeyaprakashetal., 2003; Babendreieretal., 2007; Moranetal., 2012)。其中Gamma-1、Beta、Firm-4和Firm-5在蜜蜂肠道中普遍性和丰度都较高(Babendreieretal., 2007；Martinsonetal., 2011；Powelletal., 2014)，Bifidobacterium尽管丰度低，但出现在所有正常蜜蜂肠道中(Bottacinietal., 2012)。因此Gamma-1、Beta、Firm-4、Firm-5和Bifidobacterium是蜜蜂肠道中最核心的5种优势菌(王红芳和胥保华，2020)。

东方蜜蜂Apiscerana、熊蜂Bombus及其他无刺蜂Meliponafasciculata具有和西方蜜蜂Apismellifera相似的肠道菌群属和结构，但是也有其特殊的肠道菌，群落组成存在细微的差异，这些差异随着季节、饮食、寄主年龄、种和地理位置的变化而变化(杨志波和张绍升, 2010; Guoetal., 2015; Kapheimetal., 2015)。西方蜜蜂的蜂王有一种Parasaccharibacterapium菌落明显要丰富于担任其他功能的蜜蜂，大多数不繁殖的工蜂几乎没有P.apium(Kapheimetal., 2015)。社会性蜜蜂的简单微生物群表现出宿主特异性，蜜蜂肠道中的共生物种具有互补的能量代谢能力，这意味着它们在不同的生态位中占有一席之地。此外，不相关的肠道共生菌由于共同寄生于宿主肠道内还会发生基因的水平交换，而不同寄主的菌株已经分化，蜜蜂共生菌在进化和功能上与熊蜂不同，这表明肠道共生体可能是蜜蜂物种间生物差异的关键因素(Kwongetal., 2014b)。在西方蜜蜂中，肠道菌落的共生交换可能通过接触行为或在同一朵花上觅食而发生。由数百个工蜂和一个蜂王组成的群体建立菌落的模式不会造成肠道细菌数量的瓶颈，也有利于保持菌株的多样性。除了不同蜜蜂中肠道菌可能会不同外，即便是同一种蜜蜂中，群势弱的蜂群的肠道细菌丰富度和多样性明显低于群势强的蜂群，这些相对丰度的显著差异并不是由单个蜂巢的影响造成的，而是作为一个明显的微生物群特征出现的(Ribiereetal., 2019)。

蜜蜂肠道菌的功能丰富，如Gilliamellaapicola具有代谢甘露糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖的能力。Zheng等人(2016)从蜜蜂组织中测试的所有菌株至少可以利用其中的一种糖，这表明这些肠道共生菌株可能通过帮助消化难降解的碳水化合物来增加宿主的能量摄取(Zhengetal., 2016)，正如在其他昆虫肠道和人类肠道中的细菌所观察到的那样。判断一种细菌是否作为蜜蜂核心或非核心肠道细菌的地位十分困难。Lactobacilluskunkeei是蜜蜂肠道中最常见的细菌，也存在于纯蜂蜜、花蜜和蜂粮中。然而，也有研究认为，L.kunkeei的大量存在是由于培养条件的不同，由于这些细菌在其他独立培养的研究中不存在或很少，仍需要进一步的研究(Andersonetal., 2013)。

1.2 肠道菌群在不同肠道部位的分布

蜜蜂的肠道大致可分为蜜囊、中肠、幽门和后肠。乳酸杆菌菌群在蜜囊中占据优势，与花蜜和蜂巢的菌群有很高的类似性，因此这些菌群被认为是来自花蜜，并非是肠道内的共生菌(Vasquezetal., 2012; McFredericketal., 2017)。蜜蜂的最大消化器官是中肠，但是中肠的细菌数量很少，包含3种主要共生菌(即Beta、Firm-5和Gamma-1简称BFG)，所含的细菌大部分靠近幽门(张棋麟等，2019)。幽门中的细菌主要是非核心菌株Frischellaperrara(Emeryetal., 2017)。蜜蜂的后肠又可以分为2个独立部分，即回肠和直肠。蜜蜂大部分的细菌都会聚集在肠道的深处，那些未被宿主消化的膳食化合物(如聚糖)积聚在蜜蜂的回肠和直肠，为微生物群提供主要的碳、氮来源(Flintetal., 2017)。回肠中主要包含Gilliamellaapicola和Snodgrassellaalvi两类核心菌群，虽然回肠比中肠小，但是细菌数量远高于中肠。回肠具有较深的内折以扩大了细菌的接触面积来吸收未被中肠消化的营养。直肠有营养十分丰富的环境，因此栖息了绝大部分稳定的微生物，其中LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5和Bifidobacteriumasteroides是优势菌种，主要位于肠腔当中(Martinsonetal., 2012; Kwongetal., 2017)。即便蜜蜂具有许多不同类型的微生物，但是肠道内部的多样性比整个群体的多样性要低得多(Ellegaard and Engel, 2019)。

1.3 蜜蜂不同发育阶段的核心菌群变化

蜜蜂为全变态膜翅目社会性昆虫，一生经历卵、幼虫、蛹和成虫4个发育阶段，每个发育阶段都有显著的发育特征(Remboldetal., 1980)。发育中的幼虫在化蛹前有一个不连续的肠道(前肠和后肠没有连接)，因此，这一阶段的幼虫是包括细菌或病毒在内的许多主要病原体的目标(Rauchetal., 2009; Blanchardetal., 2014)。蜜蜂的一生中，肠道菌群的变化会随着蜜蜂不同发育阶段的变化而变化，最后趋向于稳定。研究表明，无论是中华蜜蜂还是西方蜜蜂，新出生的蜜蜂和幼虫肠道中几乎没有或没有细菌(Martinsonetal., 2012; Guoetal., 2015)。中华蜜蜂幼虫从5 d开始，其成年工蜂肠道中具有的4种细菌(Lactobacillus,S.alvi,Bifidobacterium,G.apicola)数量开始增加，随后下降，并在其余时间保持稳定(Guoetal., 2015)。蜜蜂会通过蜂巢、孵化卵细胞或者是工蜂的社会接触获得肠道细菌(Martinsonetal., 2012)。当蜜蜂达到成年工蜂的年龄时，它们会面临着充满细菌的环境。对于中华蜜蜂，Lactobacillus会在第10天达到高峰(Guoetal., 2015)，在12～21 d期间，蜜蜂最重要的生理生化过程是参与食物生产，如花蜜和蜂粮的加工。如S.alvi和LactobacillusFirm-5细菌在20～25 d会趋于稳定，而Bifidobacterium属和G.apicola则在25～30 d，细菌在第15天后开始下降，肠道细菌的减少可能是由于觅食的蜜蜂在15 d后第一次离开蜂巢时排便所致(Guoetal., 2015)。S.alvi、G.apicola和Bifidobacterium在15～20 d之间达到高峰，这与花蜜和蜜蜂蜂粮加工的年龄相对应。中华蜜蜂肠道微生物的数量在第15天或第20天之后开始下降，但在20 d之后，细菌有一个稳定的时期。

西方蜜蜂中核心微生物S.alvi、G.apicola和F.perrara是通过社会接触定殖肠道的(Powelletal., 2014)。因此，在0日龄的工蜂中观察到的无核心肠道菌群可以用工蜂的社会接触最少来解释。此外，Acinetobacter的相对丰度在0～1日龄时最高，说明Acinetobacter在工蜂肠道中起着重要作用；在0～1日龄这个阶段，肠道菌群的结构发生了迅速的变化，尤其是核心菌属，如Frischella、Snodgrassella和Gilliamella这3个核心属主要占据Acinetobacter的生态位(Dongetal., 2020)。Lactobacillus和Bifidobacterium有助于蜜蜂对营养的吸收和保护，将从蜜蜂肠道分离出的Lactobacillus和Bifidobacterium喷洒到蜂巢、孵卵群和花粉上，显著促进了可采蜂蜜的增加(Alberonietal., 2018)。这两个核心菌属LactobacillusFirm-5和Bifidobacterium的相对丰度在1～3日龄的期间显著增加，在第4天后趋向稳定。L.kunkeei在工蜂的其他器官和蜂粮中都能发现，它在7～12日龄时期显著增加，这个时期的工蜂主要工作是加工蜂蜜。蜜蜂个体在实验条件下蜂巢外不接触蜂蜜或哺育的工蜂，即使在8 d后也未能形成一个实质性的肠道群落，而蜜蜂暴露在自然蜂巢条件下，在4～6 d内，其稳定的群落由核心菌种主导(Powelletal., 2014)。蜜蜂幼虫化蛹后，Firm系列的菌群和Gilliamella的数量都显著下降(Hroncovaetal., 2015)。蜜蜂的9～30日龄期间，工蜂会离开蜂巢进行花粉、花蜜的采集，这个时候由于环境和饮食的变化，Bifidobacterium和F.perrara的丰度都显著降低(Andersonetal., 2018; Dongetal., 2020)。Anderson等人(2018)认为Bifidobacterium是评估工蜂年龄的细菌指标，F.perrara是否能作为年龄评估指标需要进一步的研究。当工蜂年龄上升后，肠道微生物也开始老化，后肠的核心菌群LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5和B.asteroides逐渐耗尽(Andersonetal., 2018)。

蜜蜂肠道细菌的多样性增加可能是由于幼虫食物中花粉的增加。当花粉粒与稀释的蜂蜜混合并进入后期幼虫的肠道时，pH值从酸性到中性出现了大幅度的跳跃，这表明许多适应花蜜、蜂粮和蜂蜜的嗜酸菌可能在幼虫肠道中短暂存在。即便如此，幼虫微生物群与成年蜜蜂肠道微生物群并无显著差异。虽然这些细菌可能在成年蜜蜂的营养处理中发挥作用，但在蜜蜂发育的早期和脆弱阶段，它们可能有助于幼虫免疫(Vojvodicetal., 2013)。

1.4 蜜蜂获取肠道微生物的方式

蜜蜂是群居昆虫，群居传播对维持它们的微生物群落很重要(Martinsonetal., 2012; Kochetal., 2013)。社会行为，如食物的交哺可能让昆虫肠道群体的成员将微生物传给它们的群体成员，从而建立一致的联系。蜜蜂幼虫个体在蜂巢外不接触巢脾或哺育蜂，即使在第8天后也未能形成一个实质性的肠道群落，而蜜蜂暴露在自然蜂巢条件下，在4～6 d内，其稳定的群落由核心物种主导(Powelletal., 2014)。一些革兰氏阳性的核心微生物群成员可以通过接触蜂巢表面获得，革兰氏阴性种如S.alvi、G.apicola和F.perrara似乎是通过接触哺育蜂或新鲜粪便获得的，而不是通过进食获得的(Powelletal., 2014)。G.apicola是蜜蜂核心后肠微生物群的一部分，被认为是蜜蜂肠道特有的(Kwongetal., 2014b; Kwong and Moran, 2015)。研究人员发现发现在许多花朵、花粉供应和蜜蜂肠道样本中有一个细菌谱系，在16S rRNA基因序列中与蜜蜂G.apicola菌株99%相同(Martinsonetal., 2011; Moranetal., 2012)，表明G.apicola可能是由蜜蜂从花、花粉上的环境细菌进化而来。另一种原产于欧洲和北非的独居蜜蜂Osmiabicornis，它们的幼虫可能通过土壤获得一些重要的肠道菌群，使它在没有细菌或非常有限的细菌的情况下也能有效的消化食物，以促进其发育(Kelleretal., 2013)。

1.5 不同蜜蜂肠道微生物的比较

随着人们开始关注蜜蜂的健康问题，东、西方蜜蜂肠道菌群鉴定及多样性研究也受到重视。东、西方蜜蜂肠道核心菌群大致相同，但西方蜜蜂中含有Gamma-2(Gammaproteobacteria)、Alpha-1(Bartonella)和Alpha-2(Acetobacteraceae)在东方蜜蜂中没有被检测出来，熊蜂属基本含有与西方蜜蜂相同的核心菌群，也无法检测出Alpha-2(Jeyaprakashetal., 2003; Mohr and Tebbe, 2006; Babendreieretal., 2007; Cox-Fosteretal., 2007; Martinsonetal., 2011)。

其中Bartonella主要存在于东方蜜蜂后肠中，F.perrara则主要存在于西方蜜蜂的肠道，而拟杆菌门中的Apibacter在东方蜜蜂肠道中含量较高，西方蜜蜂含量较少(Kwong and Moran, 2016；胡冲等，2020)。有研究发现肠道菌多样性差异最大的是在中蜂幼虫和意大利蜜蜂蛹之间(张义强，2013)。同种蜜蜂位于不同地区肠道微生物可能有所不同。Khan等人(2017)对沙特阿拉伯两个不同地理位置Al-Baha和Riyadh蜜蜂A.m.jemenitica肠道微生物比较，发现Riyadh比Al-Baha地区蜜蜂微生物群落的整体复杂性低(Khanetal., 2017)。肠道微生物群落的这种差异可能是由于肠道生理条件的差异，例如pH值、来自花蜜和花粉中的环境细菌、蜜蜂的年龄以及影响地理位置的季节或主要环境特征等。

2 影响蜜蜂肠道微生物菌群的因素

2.1 生物因素(病毒、细菌、瓦螨、微孢子虫等)对肠道微生物的影响

蜜蜂病毒、细菌和寄生虫等会严重破坏蜜蜂肠道微生物的平衡，是影响蜜蜂健康的重要因素(Erbanetal., 2015; Fantham and Porter, 2016; Krabergeretal., 2019)。而这些病毒和细菌能够耐受与不同草食性、杂食性和食肉性昆虫种类相关的胃、肠的生理环境(Lesteretal., 2015)。研究发现，感染欧洲软腐病(European Foulbrood)和蜜蜂囊状病(Sacbrood Virus)的幼虫肠道菌群比未感染的幼虫少，表明这些病原体与肠道细菌之间存在负相互作用(Guoetal., 2015)。共生菌S.alvi的含量与IAPV的感染率呈显著负相关(刘姗等，2017)。

狄斯瓦螨Varroadestructor的出现常常伴随着DWV，有研究发现两种γ-蛋白细菌，即Frischellaperrara和Pasteurellaceaebacterium Trm1在感染DWV的工蜂中有显著升高(Matsumotoetal., 2014)。而γ-蛋白细菌物种可能参与花粉壁的破坏(Engeletal., 2012)。而另外一种美洲幼虫腐臭病(American foulbrood，AFB)，是最具传染性和破坏性的蜜蜂疾病，病原是一种革兰氏阳性杆状芽孢杆菌，称为Paenibacilluslarvae，只有龄期小于 30 h 的蜜蜂幼虫才容易感染(Yueetal., 2008)。蜜蜂通过摄入含有P.larvae孢子的食物而感染，孢子在中肠腔中萌发，细菌在那里大量繁殖，最后攻击并破坏中肠上皮细胞，侵入血腔，并将幼虫分解成黏液团(Poppinga and Genersch, 2015)。

粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens是一种常见的存在于成年蜜蜂的病原菌，在某些条件下，如正常肠道微生物群受到干扰或存在瓦螨，会让蜜蜂感染该菌。由于蜜蜂经常暴露在可能破坏肠道微生物群的因素下，粘质沙雷氏菌感染可能是常见的，并可能导致菌落丧失；即使是少数细菌进入血腔也可能是致命的，这就支持了粘质链球菌的致病性被瓦螨加剧的可能性(Raymannetal., 2018a)。Good等人(2014)从蜜蜂肠道中分离出一些细菌并接种到花蜜中，结果发现蜜蜂并不喜欢Asaiaastilbes、Erwiniatasmaniensis和Lactobacilluskunkeei3种菌落的花蜜，而Metschnikowiareukaufii酵母则不影响蜜蜂的取食偏好。肠道微生物不仅可以作为共生菌影响蜜蜂的健康，还可能通过改变花蜜的化学成分和影响蜜蜂的觅食行为，影响蜜蜂作为传粉者的功效(Goodetal., 2014)。

瓦螨目前被认为是西方蜜蜂最具毁灭性的病原，由瓦螨引起的疾病被称为瓦螨病。瓦螨主要以蜜蜂的血淋巴为食，寄生在蜜蜂幼虫和成虫身上导致幼虫死亡，如果没有得到及时的防治，蜂群很快就会衰落死亡。(周婷等，2007)。瓦螨寄生的蜜蜂肠道细菌中Bartonella的相对丰度会增加，在瓦螨病存在下观察到更丰富的细菌是S.alvi，这种细菌在后肠形成了生物膜的内层，而另一种细菌G.apicola形成了外层。G.apicola未受到瓦螨病的影响，由此推测，瓦螨寄生的蜜蜂体内的乳酸杆菌和Snodgrassella的相对丰度与生物膜厚度的增加有关，这是对瓦螨感染的反应(Hubertetal., 2017)。亮热厉螨Tropilaelapsmercedesae是亚洲蜜蜂的一种寄生虫，感染了T.mercedesae的蜜蜂乳酸杆菌丰富度明显高于同期未感染蜜蜂(Maetal., 2019)。

微孢子虫病是蜜蜂的主要病害之一，其病原包括蜜蜂微孢子虫Nosemaapis和东方蜜蜂微孢子虫Nosemaceranae。微孢子虫只感染蜜蜂的中肠，会一定程度上改变肠道微生物群的总体组成(Rubanovetal., 2019)。N.ceranae感染导致饲糖蜜蜂肠道中Snodgrassella的丰度较高，Serratiamarcescens的丰度较低，此外，还会抑制与细胞更新有关的基因，导致营养不良，增加蜜蜂死亡率(Huang and Solter, 2013)。抗生素对肠道细菌的清除对蜜蜂免疫系统的功能产生了负面影响，增加蜜蜂感染微孢子虫病的可能性(Lietal., 2017)。白垩病是由蜜蜂球囊菌Ascosphaeraapis(简称球囊菌)特异性侵染蜜蜂幼虫而导致，这种菌能够降解宿主体内的营养物质，最后导致宿主死亡。(郭睿等，2018)。

2.2 非生物因素(杀虫剂、除草剂、花粉等)对肠道微生物群落的影响

除了上述生物因素对蜜蜂肠道微生物产生严重的影响，一些非生物因素如杀虫剂、花粉、温度、季节以及蜜蜂所处的地理位置等都有可能对蜜蜂的肠道丰度和多样性造成影响(Goreetal., 2017; Riciglianoetal., 2017; Yangetal., 2019; Wangetal., 2020)。在测定3种农药(毒死蜱、乐果和双甲脒)对蜜蜂的毒性时，发现乐果是3种农药中毒性最大的，并且对西方蜜蜂的毒性大于东方蜜蜂，而双甲脒对中华蜜蜂和西方蜜蜂毒性最小(Yangetal., 2019)。接触吡虫啉也会导致蜂巢中蜜蜂的死亡率升高，并增加了受病原体感染的易感性，暴露于吡虫啉的蜜蜂血淋巴细胞在体外的过氧化氢水平降低(Walderdorffetal., 2018)。尽管不同微生物种类之间存在潜在的调节相互作用，但肠道内过氧化氢水平的降低被认为是导致肠道微生物群发生变化的最可能原因(Walderdorffetal., 2018)。但是如今并没有发现吡虫啉影响蜜蜂肠道细菌群落的证据，甚至发现在吡虫啉存在下，蜜蜂肠道细菌可以生长(Raymannetal., 2018b)。而一种杀虫剂烯啶虫胺，则会扰乱肠道微生物的平衡，降低蜜蜂的摄入量和生存率(Zhuetal., 2020)。氟胺氰菊酯是一种常见的有机杀螨剂，在西方蜜蜂的食物中添加少剂量的氟胺氰菊酯导致了蜜蜂肠道Proteobacteria类细菌滋生，高浓度的氟胺氰菊酯则引起子囊菌门的滋生(廖春华，2019)。农药会直接或间接对蜜蜂等授粉昆虫产生影响，而从苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)中提取的Cry1Ie蛋白则被认为是我国开发Bt玉米新品种防治玉米害虫的候选蛋白，在实验室条件下，发现Cry1Ie毒素对中国蜜蜂肠道菌群无影响(Jiaetal., 2017)。

除草剂和一些杀菌剂对蜜蜂的影响可能也不亚于杀虫剂。在暴露于草甘膦的蜜蜂中，占优势的肠道微生物种群的相对和绝对丰度降低，成年工蜂接触草甘膦之后，增加了随后接触粘质沙雷氏菌的蜜蜂死亡率(Mottaetal., 2018)。蜜蜂幼虫的免疫功能尚不健全，更容易受到病原体的侵害，高浓度的草甘膦影响了新生蜜蜂的肠道细菌群落，降低了幼蜂的存活率，由此可推测草甘膦会导致肠道微生物减少，降低蜜蜂的免疫能力(Daietal., 2018)。尽管低剂量杀菌剂对蜜蜂不致命，但高剂量的接触对蜜蜂也是相当有害的，导致幼虫死亡率增高，并改变其觅食行为(Zhuetal., 2014)。杀菌剂也会导致熊蜂肠道的大量菌落损失(Steffanetal., 2017)。

花粉也是影响蜜蜂肠道微生物的重要因素。如果蜜蜂需要消耗大量的花粉来获得足够的营养，便会需要更多的细菌定殖在直肠中消化花粉。花粉的营养质量，以及不同地点的花粉资源，也可能影响菌群组成 (Jonesetal., 2018)。从花粉中分离出来的酵母菌具有杀菌和发酵的特性，这两种特性对幼蜂的发育都是至关重要的；这种生态关联暗示了蜜蜂与其花粉微生物群之间高度的互利共生(Steffanetal., 2017)。花粉的消耗刺激了对蜜蜂有毒糖(木糖、阿拉伯糖、甘露糖)的水解，在肠道前端产生的糖分积聚在中肠，并持续存在于后肠，花粉消耗显著影响消化道细菌总数和特异性丰度(Riciglianoetal., 2017)。除了花粉之外，糖分也是影响蜜蜂肠道的重要因素之一。蜜蜂对于蜂蜜的采食明显高于对果葡糖浆及蔗糖的采食，这有可能是因为果葡糖浆对比蜂蜜缺乏必要的营养和氨基酸，降低了蜜蜂的采食率(丁琳，2016)。Wang等人(2020)测定了蜜蜂冬季取食蜂蜜、蔗糖和高果糖糖浆前后，中肠和后肠的细菌群落情况，发现季节、喂食的糖类型以及肠道空间的变化只会影响蜜蜂肠道优势类群的丰度，但不会影响优势类群的组成，优势类群是相对保守的；喂食蔗糖后，中肠的微生物多样性会高于喂食高果糖浆和蜂蜜组，而后肠的微生物低于高果糖浆和蜂蜜组。作为冬季食品的糖类对蜜蜂肠道优势菌群的相对丰度有影响，而对类群的相对丰度没有影响，从而影响蜜蜂越冬期间的健康和安全，蔗糖是非常适合蜜蜂越冬的食物(Wangetal., 2020)。也有研究认为蔗糖日粮增加了Rhizobiaceae、Acetobacteraceae、L.kunkeei这些亚优势核心菌的相对丰度，降低了F.perrara的相对丰度，显著改变了细菌组成(Tayloretal., 2019)。

肠道微生物多样性在摄入抗生素后的几天内就会减少,而且很少能完全恢复到初始细菌群落组成(Sekirovetal., 2008; Dethlefsen and Relman, 2011)。养蜂人最常用的两种抗生素是四环素(或相关化合物土霉素)和泰乐菌素，而在蜜蜂肠道8种核心细菌中，4种细菌Bifidobacterium、LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5和Snodgrassellaalvi受到四环素处理后丰度显著下降，导致蜜蜂死亡率升高(Goreetal., 2017)。但是同时Gore等人(2017)也发现具有自然获得肠道微生物群的蜜蜂，经四环素处理并在实验室无菌条件下保存的蜜蜂表现出更高的死亡率，这在没有微生物组(无菌蜜蜂)的处理蜜蜂中没有观察到，这意味着不是四环素影响蜜蜂的健康，而是蜜蜂肠道菌群失调。虽然对无菌蜜蜂没有影响表明抗生素在使用的浓度下对蜜蜂没有直接伤害，但很难将四环素对肠道微生物群的影响与对宿主的影响分开，有可能是四环素改变了宿主对病原体的易感性(Goreetal., 2017)。目前未发现长距离迁移会导致蜜蜂种群肠道微生物群落发生大的变化，在冬季天然的花卉食物对蜜蜂肠道微生物群的组成和功能只有细微的影响(Rothmanetal., 2018)。

3 蜜蜂肠道微生物的作用

3.1 蜜蜂肠道菌对蜜蜂健康的影响

蜜蜂一生中会遇到各种生物与非生物的压力，肠道菌对于蜜蜂的健康起到非常重要的作用(Mattilaetal., 2012; Goodetal., 2014; Emeryetal., 2017)。蜜蜂以花粉为食，蜜蜂肠道微生物菌群能够消化坚硬的花粉外壁，并消化吸收花粉中多种多糖、富含能量的物质，在培养的细菌基因组序列和亚基因组数据中获得了多糖降解基因，揭示了Bifidobacterium和Gilliamella消化蜜蜂肠道中的多糖 (Zhengetal., 2019)。一些容易获得的花粉营养物质(如氨基酸、糖和维生素)很可能被中肠的细菌吸收，而更难消化的化合物则由后肠中的微生物菌群来消化(Kesnerovaetal., 2017)。如今可确定3个主要活跃在肠道的细菌类(γProteobacteria、Bacilli和Actinobacteria)都参与分解复杂的大分子(如多糖和多肽)。微生物群落通过使用群落水平的生理特征来实现代谢这些富含碳的食物来源的能力(Leeetal., 2015)。总的来说，蜜蜂的肠道微生物区系中存在着具有独特作用的细菌成员，这些细菌最终可以为宿主处理植物性食物做出贡献。

蜜蜂肠道中含有的各种细菌可共同完成某项功能，或是各司其职。使用含有Lactobacillu和Bifidobacterium的糖浆制剂喷洒在空旷的养蜂场的蜂巢上，会导致蜜蜂肠道中Acetobacteraceae和Bifidobacteriumspp.的相对丰度有所增加，是由于它们参与了蜜蜂的营养和保护(Alberonietal., 2018)。而从蜜蜂中肠分离获得的L.kunkei的混合物能降低感染Paenibacilluslarvae的死亡率，增加乳酸杆菌的数量，从而使幼虫生存能力得到了提高(Arredondoetal., 2018)。同样的，植物乳酸杆菌Lactobacilluplantarum也能减轻Nosemaspp.引起的蜜蜂肠道微生物群落的变化(Diazetal., 2019)。

Engel等人(2015a)发现蜜蜂肠道中的两种γ蛋白杆菌之一的Frischellaperrara，是引起意蜂“结痂”表型的原因；这种表型的特征是在中肠-后肠交界处的幽门内形成一个深棕色到黑色的沉积物，形成一个局部的薄条带，靠近马氏管。该表型在成年工蜂出现后5～7 d形成。结痂蜜蜂的比例在不同的蜂群中有所不同(通常为40%～90%)，但与肠道中的F.perrara的丰度密切相关；同时用实验室出现的蜜蜂进行实验，表明用培植的F.perrara菌株定殖足以诱导结痂(Engeletal., 2015a)。关于蜜蜂饮食质量影响的研究表明，与后肠的其它肠道细菌相比，食用陈旧的花粉导致F.perrara的丰度显著增加，这与宿主发育受损和死亡率增加有关(Maesetal., 2016)。但有趣的是F.perrara不仅诱导黑化反应，导致结痂表型，而且还激活宿主免疫系统的其他部分，包括信号感知和效应器功能(Emeryetal., 2017)。这种现象或许是免疫启动，预先激活免疫系统可以增强对随后病原体侵扰的保护，F.perrara与宿主的关系或许不能简单的以有害或有益来概括，需要更进一步的研究。

3.2 肠道微生物对蜜蜂免疫的影响

肠道微生物群落可以通过调节免疫系统极大地影响蜜蜂的健康。然而，对于许多重要的昆虫来说，肠道微生物菌群和其免疫功能之间的关系仍然知之甚少。抗菌肽(AMPs)是昆虫抵御病原体入侵的天然免疫系统的重要组成部分。这些短肽在细菌、真菌和原生动物感染时释放，通过穿膜和抑制蛋白折叠而破坏微生物细胞(Danihlíketal., 2016)。在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的免疫刺激下，蜜蜂血淋巴中诱导了4种AMPs产物Abaecin、Apidaecin、Defensin和Hymenoptaecin (Casteelsetal., 1990; Danihlíketal., 2016)。Kwong等人(2017)发现，在蜜蜂肠道微生物可以影响AMP-Apidaecin在血淋巴的浓度，导致Hymenoptaecin水平升高；不同的微生物菌群成员对蜜蜂免疫可能起不同的调节作用，表明肠道微生物群发挥的作用不仅限于肠道而是整个系统，包括血淋巴；此外，还证明Apidaecin存在于肠道腔内，这打开了蜜蜂免疫系统在构建肠道微生物群落中发挥作用的可能性。单靠S.alvi的定殖并不能增加Hymenoptaecin的表达，这表明S.alvi不能进行Hymenoptaecin的生产途径(Kwongetal., 2017)。Al-Ghamdi等人(2018)探讨了幼虫食物中添加Paenibacilluslarvae孢子和肠道细菌是否能够降低P.larvae感染西方蜜蜂幼虫的致死效应，结果表明L.kunkeei和Bacilluslicheniformis均能降低蜜蜂幼虫感染孢子后的死亡率，而其他细菌Fructobacillusfructosus和Bacillussubtilis在一定程度上降低幼虫的死亡率(Al-Ghamdietal., 2018)。另外，Bifidobacterium群落在蜜蜂肠道中的活性越高，病原体的活性就越低；这种相关关系表明，Bifidobacterium可能通过调节蜜蜂的免疫反应或排除病原体，为蜜蜂提供健康益处(Evans and Lopez, 2004)。而另一种独居蜜蜂Osmiabicornis除了蜜蜂典型的肠道微生物群外，还从其肠道中发现了G2II、C4和M1株的Bacillussubtilis，能抑制了Ascosphaeraspp.和Paenibacillus的生长(Sabateetal., 2009)，这些肠道微生物可能在蜜蜂免疫防御中发挥重要作用。

3.3 肠道微生物菌群对蜜蜂营养代谢的影响

由于蜜蜂不同肠道部位肠道菌的种类不一样，因此不同的部位代谢物也不同。对蜜蜂血淋巴的单独分析发现，其他昆虫的肠道菌能产生对宿主有益的必需氨基酸，蜜蜂也同样如此(Engel and Moran, 2013)。在蜜蜂对花蜜和花粉的代谢过程中，蜜蜂的肠道菌群起着重要的作用(Riciglianoetal., 2017; Maruscakovaetal., 2020)。蜜蜂肠道中相当大一部分微生物菌群进行食物碳水化合物的发酵。考虑到蜜蜂富含碳水化合物的饮食(由花蜜和花粉组成)，通过进化肠道微生物菌群以这类资源为生并不奇怪。G.apicola、F.perrara、LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5和蜜蜂相关的B.asteroides都能代谢葡萄糖和果糖，这两种糖是蜜蜂食物中含量最丰富的糖(Engeletal., 2013; Ellegaardetal., 2015)。与熊蜂肠道微生物群落成员相比，意蜂中的B.asteroides物种群具有丰富多样的基因，负责碳水化合物的利用 (Bottacinietal., 2012)。这些发酵细菌包括蜜蜂特有的乳杆菌属和双歧杆菌属。蜜蜂肠道的双歧杆菌和乳酸杆菌都有大量功能未知的细胞表面蛋白，可能参与植物成分的粘附或降解(Kwongetal., 2014a; Ellegaardetal., 2015)。蜜蜂肠道中另一种主要的发酵微生物是G.apicola，G.apicola菌株的基因组分析已经确定了一大类基因，这些基因负责糖类的吸收和发酵，但存在不完全的三羧酸(TCA)循环和退化的需氧呼吸链(Kwongetal., 2014b)。蜜蜂肠道中存在不同的代谢生态位，这在一定程度上可以解释为细菌沿着肠道各个部位的不同分布 (Kesnerovaetal., 2017)。肠道微生物菌群诱导了与营养和代谢相关的宿主表型，肠道微生物群改变了不同肠腔的理化性质和代谢谱，而糖酵解是蜜蜂肠道的主要代谢活动(Zhengetal., 2017)。发酵的最终产物因种类而异，但通常包括乳酸和醋酸(Kwong and Moran, 2016)。在大多数情况下，几种肠道菌会代谢同一化合物，表明蜜蜂肠道细菌具有重叠的代谢能力(Bonilla-Rosso and Engel, 2018)。

4 蜜蜂肠道微生物的研究方法

4.1 蜜蜂肠道微生物的分离和培养方法

蜜蜂肠道微生物群落分离和鉴定首先需要确定样本是整个肠道或部分肠道。对于蜜蜂肠道的解剖，使用1%氯水溶液(二氯异氰尿酸钠或过氯酸钠)擦拭蜜蜂全身，清除可能会影响实验结果的其他微生物及核酸分子。每头蜜蜂浸泡上述溶液2～7 min后，用无菌纯净水冲洗3次。为了避免影响后续PCR的反应，导致结果出现误差，因此需要确保无菌水冲洗了所有含氯试剂(Engeletal., 2015b)。提取DNA之前对昆虫进行表面消毒是一种常见的做法，但也有人质疑这一耗时的步骤是否对微生物群落分析有任何影响，因此分别用5种不同的方法，即冷冻、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)、溴化十六溴铵(CTAB)和无防腐剂室温进行处理，将4种昆虫的复制个体完整保存两个月，然后对整个标本进行16S rRNA基因测序，与未消毒的昆虫相比，表面消毒并没有改变细菌群落结构，这可能是由于昆虫体内的微生物生物量相对于其表面要大得多(Hammeretal., 2015)。在对成百上千的昆虫标本进行大规模的分子研究时，表面消毒可能不值得花费时间和精力，这些信息将有助于研究人员设计不同的方案和策略进行实验。解剖肠道组织后，加入适量无菌Krebs-Ringer 溶液，在漩涡振荡器上用灭菌的研磨棒充分研磨肠道，然后将研磨液用无菌厌氧的生理盐水进行10倍梯度稀释，取10-1、10-3、10-53个梯度的稀释液(100～150 μL)涂布于不同培养基的培养皿上(也可放入液体培养基中)。将涂布后的平板分别放至35～37℃厌氧培养箱(含氧量≤1%)中培养48～72 h。每个培养基和梯度设3次重复，对表征不同的菌落进行厌氧挑菌(董志祥等，2018)。

4.2 蜜蜂肠道微生物的保存方法

目前蜜蜂肠道菌的培养方法是通过无菌操作从蜜蜂肠道中提取共生菌，接入适合该菌生长的培养基(如胰酪胨大豆琼脂培养基、心浸液琼脂培养基、脑心浸液琼脂以及西红柿汁琼脂培养基(Oxoid、Basingstoke、Hampshire、UK)，乳酸细菌培养基(MRS)，液体培养基(Lactobacillus Carrying Media)等)，接着将培养皿放到35～37℃的恒温培养箱中；但大部分蜜蜂肠道菌都需要一个低氧或者无氧的环境才能生长，因此一个专门的密封设备、CO2培养箱和N2的培养箱等装置是有利于肠道菌的培养(Engeletal., 2015b)。

4.3 蜜蜂肠道微生物的分子鉴定方法

随着现代分子生物学技术的发展，一些以16S rRNA基因序列分析为基础的分子技术被广泛用于微生物的鉴定、分类以及微生物之间进化关系的确定等，如DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)、TRFLP(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)等常规分子生物学技术(Shietal., 2010)，以及可精确定位细菌在昆虫肠道中分布的位置荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)方法(Engel and Moran, 2013)，这些技术主要用来鉴定或描述一些特殊菌群的特征。变性梯度凝胶电泳(DGGE)是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。DGGE对微生态的分析一般包括3个步骤：核酸提取、16S rRNA序列的PCR扩增以及DGGE指纹图谱分析。通过克隆、测序建立微生物区系的16S rRNA/DNA文库，通过系统发育分析，建立进化树，从而获得微生物多样性信息。末端限制性片段长度多态性(TRFLP)分析是一种分析生物群落的指纹技术，它的基础原理涉及末端荧光标记的PCR产物的限制性酶切，优点是可以检测微生物群落中较少的种群。荧光原位杂交技术是一种重要的非放射性原位杂交技术，原理是利用报告分子(如生物素、地高辛等)标记核酸探针，然后将探针与染色体或DNA纤维切片上的靶DNA杂交，若两者同源互补，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。此时可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对DNA进行定性、定量或相对定位分析。微生物组数据的获得通常有3种方式，即16Sr RNA基因序列测定、宏基因组测定(描述细菌的潜在功能)、宏转录组数据(描述活性基因的表达)(Goodrichetal., 2014)。

4.4 无菌蜜蜂的构建方法

无菌蜜蜂一般使用两种方式构建，即从蜜蜂卵或者从晚期蛹开始培养。从健康的蜂巢中收集到蜜蜂卵经过消毒后，挑到无菌的96孔板中放置在34℃、相对湿度为80%培养箱内避光培养。前3 d使用无菌的蜂王浆喂养，然后用无菌的蜂粮替代蜂王浆。每24 h将幼虫转移至新的含有饲料的孔板内培养，即将化蛹时，将幼虫移至垫有两层滤纸的24孔板内准备化蛹和羽化。

另一种构建方式根据Zheng等人(2017)的方法，从蜂箱的孵卵架中手动取出晚期蛹(即有深色眼睛和角质层的蛹)，并放入无菌塑料箱中。如果蜜蜂自己啃出蜂巢，可能会被巢脾表面残留的肠道共生菌接种。让蛹在35℃的生长室中羽化。新羽化的个体被保存在一个带有可移动底座和通风孔的无菌杯状贮藏笼中，并用灭菌的蔗糖糖浆(0.5 M)和蜂粮喂养。蜂粮提前用γ射线(30 kgy)灭菌。灭菌的糖浆铺在LB板上并在37℃下过夜孵育来验证灭菌是否完全(Zhengetal., 2017)。

5 蜜蜂肠道微生物的应用

蜜蜂一生中会受到许多病毒、寄生虫等的病原体感染，为了阻止这些病原体的传播，科学家们试图基因改造与昆虫相关的共生微生物(Durvasulaetal., 1997)。转基因项目分3个阶段展开：首先，必须识别并描述来自肠道的细菌，它们具有作为转基因载体的巨大潜力；其次，以报告蛋白转化细菌，测试并描述其性能，包括蜜蜂的有效返回、在肠道中的停留时间、不干扰肠道内已建立的微生物区系、未影响蜜蜂存活；最后，所选择的细菌被转化为对抗蜜蜂病原体的效应基因(Rangbergetal., 2012)。

Leonard等人(2020)选定肠道共生菌S.alvi，用以诱导进行RNAi免疫应答，经过工程化的S.alvi可以触发瓦螨RNAi反应来杀死寄生的瓦螨，提高了蜜蜂的存活率，保护了蜜蜂的健康(Leonardetal., 2020)。副转基因(Paratransgenesis)是一种基于基因改造的共生微生物，使其表达传递效应蛋白，阻止病原体的发展或传播的方法(Durvasulaetal., 1997)。环境中广泛分布的L.kunkei也符合成为合适的副转基因候选株所需的3个标准；它是可转化的，其转化的衍生物不会对蜜蜂的健康产生负面影响，并且转化的细菌能够在蜜蜂肠道中存活至少一段时间(Rangbergetal., 2015)。

众所周知，乳酸菌可以抑制其他微生物的生长，无论它们是与宿主共同进化还是通过选择伴侣的机制被宿主从环境中吸收，乳酸菌都是有益的(McFredericketal., 2013)。Daisley等人(2020)发现，以营养小馅饼于蜂箱中添加益生菌乳酸杆菌可抑制自然发生的美洲幼虫腐臭病。利用实验室饲养的蜜蜂幼虫进行的体外实验表明，LactobacillusplantarumLp39、LactobacillusrhamnosusGR-1和LactobacilluskunkeeiBR-1(包含在生物制剂中)可以上调关键免疫基因的表达，降低病原菌载量，提高幼虫被感染后的存活率(Daisleyetal., 2020)。这些发现表明，使用含有乳酸杆菌的蜂箱补充剂可减少致病菌引起的蜂群损失，对养蜂人来说是实用和负担得起的。

从健康蜜蜂的消化道中分离出的LactobacillusbrevisB50以花粉悬浮液的形式应用于蜂群，发现蜜蜂乳酸菌与肠道菌的比例显著增加，证实了被测试的益生菌制剂可增强蜂群的免疫力，从而增强它们对传染病和应激条件的抵抗力(Maruscakovaetal., 2020)。而LactobacillussalivariusA3iob从蜜蜂肠道中分离出来(Audisio and Benitez-Ahrendts, 2011)，最近被证明是一种天然的替代品，它能提供更高的蜂蜜产量，从而对养蜂人的经济产生积极的影响 (Fanciottietal., 2018)。蜜蜂肠道中解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，这两种菌都可用于纳豆的发酵生产(徐艳等，2017)。益生菌制剂不仅是对蜜蜂有益的，还有研究发现从蜜蜂产品中分离出的L.kunkeiYB38可能促进人类产生IgA，提高人体的免疫力(Asamaetal., 2015)。随着生物技术的进步，关于蜜蜂肠道微生物的应用一定会越来越完善，对人类生产、健康方面都带来积极的影响。

6 问题与展望

随着人们对蜜蜂健康的关注，近年蜜蜂肠道微生物的研究与应用取得了长足的进展。这一领域之所以成为蜜蜂研究的热点，主要仍存在许多问题有待突破。

蜜蜂肠道具有一个仅由5个菌种组成的简单核心菌群。但是，蜜蜂的肠道结构、免疫系统、生活环境、食物组成是如何通过长期进化选择核心菌群的？可否通过外源菌株改造蜜蜂肠道菌群，从而培育优势蜂群？蜜蜂肠道中未被培养的细菌约占蜜蜂肠道细菌种类总数的32.42%(郭军，2015)，这些目前人工尚未培养的菌群在蜜蜂肠道内的功能研究仍是未来之选。蜜蜂的健康状态和肠道微生物之间存在着平衡关系，肠道微生物群落失衡时将导致病原体的入侵，因此有必要深入了解这些细菌在健康群、疾病群和受胁迫群中的结构和功能，以及它们与蜜蜂发生作用(如营养和免疫等)的分子机制。蜜蜂肠道微生物的分子操作是极具吸引力的方向，可用于构建抵抗病原、提高免疫力、改善营养结构以及提高蜂产品产量的蜜蜂群体(Casaloneetal., 2020)。