高脂饲料结合慢性应激致大鼠非酒精性脂肪肝的药物治疗

孙红爽 乜春城 李鹏霖 刘永双 高玲娜

(衡水市人民医院，河北 衡水 053000)

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种与胰岛素抵抗、糖尿病、肥胖等代谢高危因素密切相关的应激性肝损伤，主要病理特征为脂肪在肝细胞内的过度沉积〔1〕。根据NAFLD的病程发展可以分为单纯性脂肪肝变性、脂肪性肝炎、肝脏纤维化、肝硬化及肝癌〔2〕。目前对于NAFLD的治疗并没有特效制剂，生活方式的改变是首要的，药物治疗多是针对其并发症如肥胖、糖尿病、血脂紊乱、高血压和炎症等〔3〕。前期研究，通过高热量饲料结合慢性应激成功建立NAFLD大鼠模型，该模型伴随明显的氧化应激和下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)亢进〔4，5〕。因此，本研究主要从改善这两方面病变进行针对性药物治疗，选用“万能抗氧化剂”α-硫辛酸(LA)或抑制促肾上腺皮质激素(ACTH)释放药物赛庚啶(CYP)分别对高脂饲料结合慢性应激引起的大鼠NAFLD模型进行药物治疗，以观察两种药物对NAFLD模型的治疗作用特点。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)测定试剂盒均购自长春汇力生物技术有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、游离脂肪酸(FFA)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子(TNF)放射免疫分析试剂盒、皮质醇放射免疫分析试剂盒、ACTH放射免疫分析试剂盒均购自北京北方生物技术研究所； T6紫外分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司；M-96型16管手动放射免疫γ计数器购自合肥众成生物工程设备有限公司；聚合酶链反应(PCR)仪(GeneAmp PCR System 9600)购自美国Applied Biosystems公司。

1.2动物与分组 32只Wistar雄性大鼠，清洁级，购自扬州大学实验动物中心，体重150～200 g，生产许可证号：SCXK沪2002-0002。动物单笼恒温(23±2)℃、恒湿(60%±5%)饲养，明暗周期12 h，自由饮水取食。适应性喂养1 w后，所有大鼠随机分为对照组、模型组、LA组、CYP组各8只。对照组喂以普通饲料，其他3组喂以自制高脂饲料并辅以慢性应激刺激。高脂饲料配方为22%猪油+8%糖+2%胆固醇+2%食盐+66%基础饲料。慢性应激刺激采用足底电击辅以噪声刺激的方式，每日上、下午各2 h，方法同前期研究〔6〕。连续刺激8 w后，各组在高热量饲料结合慢性应激刺激的同时，LA组以100.0 mg/(kg·d)LA灌胃，CYP组以2.30 mg/(kg·d)CYP灌胃。所用药物以0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液配成相应浓度的混悬液，模型组及对照组灌胃给以相同体积的0.5%CMC-Na 溶液，均给药4 w。

1.3肝指数的测定 给药4 w后禁食12 h，称重，腹腔注射20%乌拉坦注射液麻醉(0.5 ml/100 g)。颈动脉插管取血，全血3 500 r/min离心10 min获得血清，-20℃冰箱保存。取肝脏，以4℃预冷生理盐水冲洗，滤纸吸干表面水分，称取肝脏重量。肝指数(HI)=肝脏重量(g)/体重(g)×1000。

1.4血液学指标的测定 血清皮质醇、ACTH和TNF-α用DFM-96型16管放射γ免疫计数器检测；血清TC、TG、HDL-C及FFA用比色法检测；MDA用硫代巴比妥酸(TBA)法检测，SOD用羟胺法检测。

1.5肝脏生化指标的测定 0.2 g肝组织放入2 ml生理盐水中，4℃下匀浆，制成10%肝组织匀浆，3 000 r/min离心15 min，获得上清液，于-20℃冰箱保存。用于测定肝组织TC、TG、FFA、SOD、MDA及TNF-α含量，测定方法参照试剂盒说明书。

1.6肝脏TNF-α mRNA表达的检测 新鲜肝组织100 mg，用磷酸盐缓冲液(PBS)反复漂洗，-80℃冰箱冻存，用于测定肝脏TNF-α mRNA表达。TNF-α引物：上游5′-CAGACCCTCACACTCAGATCA-3′，下游5′ TCTCCTGGTATGAAATGGCA，引物长度270 bp。PCR反应条件为94℃，30 min预变性，然后94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 30 s；运行30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，全自动凝胶成像分析系统灰度扫描，计算各组相对灰度。相对灰度=各组泳道灰度/对应泳道内参灰度。

1.7肝组织形态学观察 将动物新鲜肝组织在4℃的PBS中反复漂洗，在10%中性甲醛中固定，酒精梯度脱水，切片，苏木素-伊红(HE)染色。参照NASH临床研究评分系统〔7〕，从5个方面评价肝组织病变程度，即脂肪变性(肝细胞脂肪变性<5%计0分，5%～33%计1分，34%～66%计2分，>66%计3分)、小叶炎症(放大200倍视野下，无炎症计0分，炎症<2个计1分，2～4个计2分，>4个计3分)、汇管区炎症(在低放大倍数下无到极轻的炎症计0分，大于极轻的炎症计1分)、肝细胞气球样变(无计0分，少数细胞气球样变计1分，多数细胞气球样变或显著的气球样变计2分)和肝组织纤维化(窦周状或门静脉周围的计1分，弱的、3区、窦周状的计1分，中等的、3区、窦周状的计1分，门静脉或门静脉周围的计1分，窦周状的和门静脉/门静脉周围的计2分，桥连的纤维化计3分，硬化计4)。参照Matteoni等〔8〕的建议将病理切片进行分为4个级别：1级，单纯肝细胞脂变；2级，肝细胞脂变并伴小叶炎症；3级，肝细胞脂变并伴气球样变；4级，肝细胞脂变并伴气球样变、肝细胞内出现Mallory小体或肝纤维化。

1.8统计学分析 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组给药4 w后HI比较 与对照组〔(23.12±1.13)mg/g〕比较模型组〔(25.71±1.09)mg/g〕、LA组〔(24.57±1.53)mg/g〕及CYP组HI〔(25.16±0.89)mg/g〕均明显增大(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，LA组及CYP组HI均无明显差异(P>0.05)。提示，LA或CYP治疗对HI的增大没有明显的抑制作用。

2.2血液生化指标检测结果

2.2.1表示HPA轴激活程度的指标——血浆皮质醇和ACTH 与对照组比较，模型组、LA组及CYP组皮质醇、ACTH浓度均明显升高(P<0.01)，CYP组显著小于模型组(P<0.01)，但LA组与模型组无明显差异(P>0.05)。见表1。

2.2.2氧化应激指标——血清SOD及MDA 与对照组比较，模型组、LA组及CYP组 SOD活力均明显下降(P<0.05，P<0.01)，MDA浓度均明显升高(P<0.01)；LA组SOD活力明显高于模型组且MDA浓度明显低于模型组(P<0.01)；CYP组SOD活力与模型组无明显差异(P>0.05)，但MDA浓度明显小于模型组(P<0.05)。见表1。

2.2.3血脂检测结果 与对照组比较，模型组及CYP组TC浓度明显升高(P<0.01，P<0.05)，模型组TG浓度明显升高(P<0.01)，各组HDL-C均明显下降(P<0.01)；与模型组比较，LA组及CYP组TC浓度均明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)，CYP组TG浓度明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，LA组和CYP组HDL-C与模型组无明显差异(P>0.05)。见表1。

2.2.4血液FFA检测结果 与对照组比较，模型组、LA组及CYP组血FFA浓度均明显升高(P<0.01)；LA组及CYP组明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2.5血浆TNF-α检测结果 与对照组比较，模型组、LA组及CYP组TNF-α浓度均明显升高(P<0.01)；LA组及CYP组明显低于模型组(P<0.01)。见表1。

表1 治疗后4组生化指标比较

与对照组比较：1)P<0.05,2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05.4)P<0.01；下表同

2.3肝组织生化指标 与对照组比较，模型组、LA组及CYP组肝组织TNF-α含量均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，LA组及CYP组肝组织TNF-α均明显下降(P<0.01)。与对照组比较，模型组、LA组及CYP组肝组织SOD活力均明显下降(P<0.01)，MDA含量均明显升高(P<0.05，P<0.01)；LA组SOD活力明显高于模型组(P<0.01)，CYP组则与模型组无明显差异(P>0.05)，而LA、CYP组MDA含量均明显低于模型组(P<0.05，P<0.01)。与对照组比较，模型组及CYP组肝组织TC、TG含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，LA组TC、TG含量均明显低于模型组(P<0.01)，CYP组两指标与模型组无明显差异(P>0.05)。与对照组比较，模型组、LA组及CYP组肝组织FFA含量明显升高(P<0.05，P<0.01)；LA组及CYP组明显低于模型组(P<0.01)。见表2。

表2 治疗后各组肝组织生化指标比较

2.4肝组织TNF-α mRNA表达 与对照组(0.052±0.008)比较，模型组(0.043±0.004)及LA组TNF-α mRNA表达(0.137±0.022)显著升高(P<0.01)，CYP组(0.085±0.005)与对照组无在显著差异(P>0.05)；与模型组比较，LA组及CYP组TNF-α mRNA表达均明显下降(P<0.05，P<0.01)。见图1。

图1 肝组织TNF-α mRNA表达

2.5肝组织切片观察 对照组肝细胞结构完整、清晰，肝小叶结构清楚，所有动物都未显示有病变迹象；模型组8只动物中有7只存在轻度或中度脂变，4只有汇管区轻度炎症，3只有轻度肝细胞气球样变，4只有轻度肝纤维化，所有动物均未见小叶炎症；LA组8只动物中有5只出现轻度脂变，2只出现轻度汇管区炎症，2只有轻度肝细胞气球样变，3只有轻度肝纤维化，所有动物均未发现小叶炎症；CYP组8只动物1只有轻度脂变，1只有肝纤维化，而所有动物均未见小叶炎症、汇管区炎症及肝细胞气球样变形。见图2。

图2 各组肝组织切片(HE染色)

3 讨 论

LA是一种超强生物抗氧化剂，兼具亲水和亲脂两种特性，在水溶性和脂溶性环境中均有较好的抗氧化作用。LA易经消化道吸收，在体内部分转化为抗氧化活性更强的二氢硫辛酸(DHLA)，分布到机体组织中发挥抗氧化作用，并且可以通过血脑屏障，减少中枢神经系统的氧化损伤。LA的抗氧化作用主要体现在以下3个方面：①清除自由基和活性氧：LA 能够有效清除羟基及一氧化氮自由基、过氧化氢、单线态氧、次氯酸及过氧化亚硝基。虽然LA 不能清除超氧自由基和过氧化物自由基，但DHLA对单线态氧以外的其他自由基均有清除作用。由于体内LA和DHLA同时存在，因此，上述所有自由基均可被有效清除；②鳌合金属离子：LA能够螯合Fe、Cu及其他过渡金属元素(Mn2+、Cd2+、Zn2+等)，减少细胞内羟基自由基(·OH)的产生，进而阻断脂质过氧化；③再生内源性抗氧化剂：LA和 DHLA在体内的相互转化能再生维生素C、维生素E、谷胱甘肽、硫氧还原蛋白及泛醌等抗氧化剂，使这些抗氧化剂由氧化型转化为还原型〔9〕。

自1980 年德国的Sachse首次将LA应用到临床后，该药逐渐引起医学界重视，仅糖尿病领域，人们已广泛应用LA的强抗氧化应激能力，保护β细胞，延缓其衰减，减轻对其的攻击；保护肌肉、脂肪细胞，增强对葡萄糖的利用，增强胰岛素敏感性；保护神经细胞，改善糖尿病神经病变；保护内皮细胞，减少动脉粥样硬化等〔10，11〕。近年来也有学者尝试将LA应用于NAFLD的治疗，结果显示LA可从多个环节阻止氧应激和脂质过氧化反应，从而改善大鼠肝功能，是治疗脂肪肝的有效药物〔12，13〕。

CYP是一种非选择性5-羟色胺(HT)受体阻断剂，并且能够阻断组胺H1受体，属于第二代抗组胺药。CYP通过拮抗中枢特异性5-HT受体，减少促ACTH释放因子(CRF)的释放，进而使血浆ACTH、皮质醇浓度下降，降低HPA轴的反应活性，临床用于治疗肾上腺皮质功能亢进症。CYP也可抑制左旋多巴诱发的ACTH释放，使血浆ACTH氢化可的松反应。此外，研究发现该药有钙通道阻滞、自由基清除、抗感染、解热镇痛等作用〔14〕。王冰等〔15〕报道，外源性糖皮质激素能引起大鼠HPA轴过度激活，肝脂代谢紊乱，加剧肝脏脂质沉积，诱发大鼠肝脂肪变性。CYP可干扰HPA轴的过度激活，降低血清ACTH和皮质醇水平，逆转外源性糖皮质激素引起的大鼠肝功能损伤，改善糖脂代谢紊乱。

本研究结果显示，LA和CYP对高热量饲料结合应激引起的大鼠NAFLD均有治疗作用，表现为血脂紊乱及肝脏脂质沉积改善、血液及肝组织TNF-α表达降低、氧化应激状态改善、HI下降。但两者对该模型的治疗效果也存在差异：CYP可明显抑制HPA轴过分激活，LA不能；LA的抗氧化应激效果好于CYP。肝组织切片观察显示，CYP治疗对该模型肝损伤的改善较明显，可明显改善肝脂肪沉积、肝细胞气球样变、汇管区炎症等症状。本研究只是两种不同作用机制药物对NAFLD治疗的初步探索，进一步研究可观察两种药物对胰岛素抵抗、心血管系统损伤及脂肪组织病变等相关疾病的治疗作用，为NAFLD及其相关疾病的临床治疗提供新思路。