抑制EphA7表达对非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响

金红 莫迪 李梦雨 杨岚 张黎 武艳 季洪良 富宏然

(1牡丹江医学院附属红旗医院检验科，黑龙江 牡丹江 157011；2 牡丹江医学院第一临床医学院；牡丹江医学院附属红旗医院 3眼科；4科研科； 5牡丹江医学院医药研究中心)

根据组织学特征肺癌可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌。虽然空气污染、烟草烟雾等多种因素都能增加肺癌的发病率，但肺癌形成的机制尚不清楚〔1,2〕。转移是癌症的致死特征之一，约占人类癌症死亡的90%〔3〕，肺癌转移是一个复杂过程，包括细胞迁移、局部浸润和播散，阻断其中步骤之一能够有效地防止继发性肿瘤在体内扩散〔4,5〕。受体酪氨酸激酶(RTKs)为细胞增殖、分化和迁移的主要调控因子〔6〕。抑制酪氨酸蛋白激酶受体(Eph)代表最大的RTKs家族，并与ephrins配体相互作用。研究证实RTKs可参与肿瘤生长、转移和新血管的形成〔7,8〕。本研究用小干扰RNA(siRNA)沉默EphA7，研究其对非小细胞肺癌NCI-H1975细胞迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。

1 资料与方法

1.1一般材料 人肺腺癌NCI-H1975细胞株购自中国上海中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，10%胎牛血清和DMEM培养基购自美国GIBCO公司，转染试剂盒细胞凋亡试剂购自美国Promega公司，CCK8检测试剂盒购自中国海门碧云天生物技术研究所，抗EphA7抗体、抗B细胞淋巴瘤(Bcl)-2抗体、抗Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体、抗蛋白酪氨酸磷酸酶(PTEN)抗体、抗磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体、抗蛋白激酶B(AKT)抗体和抗磷酸化(p)-AKT抗体购自美国Abcam。

1.2细胞培养、转染与分组 NCI-H1975细胞复苏后，待细胞生长到一定数量后，0.25% 胰酶消化，用含10%血清的二甲基亚砜(DMSO)培养基重悬细胞。计数以后调整细胞浓度为5×105个/ml，按每孔0.1 ml接种于96孔板上，37℃、5%CO2条件进行培养。将NCI-H1975细胞分为3组，抑制组和NC组分别转染EphA7抑制剂和EphA7-NC,空白对照组不转染，48 h后收集细胞。

1.3噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖 取生长状态良好的对数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化，计数，将细胞以5×105个/ml接种于96孔培养板中，然后向其中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，在37℃培养箱中培养24 h，待细胞贴壁生长并达80%时，每孔加入10 μl MTT溶液继续培养4 h，终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入100 μl DMSO置于摇床上低速震荡10 min，然后在490 nm波长下用酶标仪测定每个样本的吸光度(OD)值，每个样品重复做3次。

1.4实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测EphA7 mRNA的表达 从每个样品中提取总RNA(1 μg)利用逆转录酶(M-MLV)可生成cDNA。使用SYBR Green PCR检测系统进行检测。EphA7引物序列：上游5′-CTAATGTTGGATTGTTGGCAAAAG-3′，下游5′-TTGATCCAGAAGAGGGCTTATTG-3′；内参GAPDH引物序列：上游 5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′，下游5′-TCCACCACCCAGTTGCTGTA-3′。反应条件：95℃15 s，60℃ 30 s和72℃30 s，40个循环。设置3个复孔，数据用Sequence detection software1.3系统处理，用2-ΔΔCt给出EphA7 mRNA的相对值。

1.5用末端转移酶的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色法检测细胞凋亡 细胞用4%多聚甲醛在室温下固定30～60 min，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，用含0.1% Triton X-100的枸橼酸钠缓冲液浸透，冰浴孵育2 min，用PBS洗涤2次，加入50 μl原位凋亡检测试剂盒的TUNEL检测液，细胞核与4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，于37℃下避光孵育60 min，用PBS洗涤3次，用抗荧光淬灭封片液封片后在荧光显微镜下进行观察，激发光波长范围450～500 nm，发射波长范围515～565 nm(绿色荧光)，荧光显微镜下计数细胞总数和TUNEL阳性细胞数，并计算细胞凋亡率(凋亡阳性细胞数/细胞总数)。

1.6采用 Transwell实验检测细胞侵袭与迁移 (1)细胞在37℃孵育24 h后收集各组处理后的细胞，制备细胞悬液，并将浓度为5×105个/ml细胞接种到Transwell小室中，向小室内加入含有10%胎牛血清培养液，在37℃、5% CO2培养箱中孵育24 h，用棉签擦去基质胶和上室内没有被侵袭的细胞，弃掉下室液体，下室已经被侵袭的底层细胞用95%乙醇固定，0.2%结晶紫染色1 h，纯水轻轻洗小室底部，显微镜下每孔取左上、右上、中、左下、右下5个视野拍照(固定位置，排除主观选择因素)，对图片上被染色细胞进行计数。(2)细胞在37℃孵育24 h后收集各组处理后的细胞，制备细胞悬液，并将浓度为5×105个/ml细胞接种到Transwell小室中，上层室无血清，底部加入含有10%胎牛血清培养液，接着在37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h，用棉签将上层没有被侵袭的细胞清除，弃掉下室液体，下室已经被侵袭的底层细胞用95%乙醇固定，0.2%结晶紫染色1 h，用纯水轻轻洗小室底部，显微镜下每孔取左上、右上、中、左下、右下5个视野拍照(固定位置，排除主观选择因素)，对图片上被染色细胞进行计数。

1.7使用蛋白印迹法检测信号通路蛋白表达水平 将药物处理后的细胞收集加入裂解液，各组提取的总蛋白样品30～90 μg在10%～15%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，将蛋白质从凝胶转印到硝酸纤维素膜，加入封闭液(5%脱脂奶粉)，浸泡被转印膜，室温反应1 h，来封闭转印膜上的一些非特异性蛋白质的潜在结合位点，防止发生非特异性反应；转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹；然后用第一抗体在4℃孵育过夜(抗PTEN抗体、抗GAPDH抗体、抗AKT抗体和抗p-AKT抗体)，弃一抗，用0.01 mol/L包含0.5% Tween20的PBS分别洗膜，10 min×3次，振荡；加入荧光标记的二抗溶液，室温下反应1 h，保持平缓摇动；弃二抗，用0.01 mol/L PBS洗膜，10 min×4次，振荡。电化学发光(ECL)显色：将膜浸于ECL发光液中，避光显色3 min，将膜用滤纸吸干，以β-actin作为内参对照，用Tanon5200全自动化学发光图像分析系统进行扫描，分析目标条带的灰度值。

1.8统计学分析 采用SPSS16.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组EphA7 mRNA及蛋白表达 与空白对照组比较，抑制组EphA7 mRNA和蛋白表达水平明显减少(P<0.05，P<0.01)，见表1，图1。

表1 各组EphA7 mRNA及蛋白表达水平

与空白对照组比较：1)P<0.05,2)P<0.01；下表同

图1 各组EphA7蛋白表达水平

2.2抑制EPHA7表达对各组细胞增殖抑制作用 与空白对照组比较，抑制组细胞活力明显降低(P<0.01)，细胞凋亡率明显增加(P<0.01)，见图2，表2。

图2 抑制EphA7表达对各组细胞凋亡的影响(×100)

表2 抑制EphA7表达对各组细胞活力及细胞凋亡率的影响

2.3抑制EphA7表达对各组细胞的侵袭和迁移的影响 与空白对照组比较，抑制组的侵袭和迁移的细胞数明显较少(均P<0.05)，见表3。

表3 抑制EphA7表达对各组细胞的侵袭和迁移的影响

2.4抑制EphA7表达对各组细胞信号通路蛋白(AKT、p-AKT和PTEN)表达水平的影响 与空白对照组比较，抑制组的PTEN蛋白表达水平明显升高(P<0.01)，p-AKT蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，总AKT蛋白差异无统计学意义(P>0.05)，见表4、图3。

表4 抑制EphA7表达对各组细胞信号通路蛋白表达水平的影响

1～3:空白对照组，NC组，抑制组图3 抑制EphA7表达对各组细胞的信号通路蛋白表达水平的影响

3 讨 论

目前，肺癌晚期患者病死率较高，与肺癌晚期恶性肿瘤细胞强大的侵袭和转移能力有关。研究发现，Eph受体和ephrin配体调控是肿瘤生长、转移和不良结局的关键〔9～11〕，现已证实EphA7在肾血管系统中高度表达，EphA7的表达在肺癌组织中也被转录激活〔12〕，但很少有研究阐明EphA7在肿瘤致病性中的作用，本研究首次证明了沉默EphA7可以抑制NCI-H1975细胞的细胞活力和细胞的迁移与侵袭，并在NCI-H1975细胞中通过上调PTEN抑制AKT信号通路。

在正常情况下，机体内的细胞分裂和增殖受到信号转导通路的级联调控，如果信号转导通路中的促进生长和抑制生长的平衡作用遭到破坏，就会导致细胞的增殖失控和恶性转移。目前细胞中的膜受体Eph(ras-MAPK)信号转导通路、蛋白酪氨酸激酶信号传导及转录激活蛋白(JAK-STAT)信号转导通路和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号转导通路在细胞增殖失控与恶性转移中起重要作用，与恶性肿瘤晚期的侵袭和转移密切相关。信号通路调控异常与肿瘤发生如细胞迁移和侵袭等密切相关，是目前肿瘤治疗的靶点，对信号通路进行有效的调节是治疗肿瘤的关键。AKT/mTOR/STAT3信号通路在调节癌细胞生长、侵袭和凋亡中起重要作用〔13〕。AKT的活化减少，从而抑制信号通路达到抑制细胞生长和增殖的作用，降低了癌细胞增殖和凋亡抵抗。PI3K/AKT通路是癌症发展的一个重要信号通路和代谢途径。

本研究结果表明，EphA7的沉默下调了非小细胞肺癌细胞中PTEN-AKT信号通路。此外，siEphA7作为肿瘤抑制因子调节细胞侵袭和迁移。