基因融合介导EGFR-TKI获得性耐药

邵宜 钟殿胜

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）约占肺癌的80%[1]。具有表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）敏感突变的患者对酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）具有良好反应，一代TKIs的总反应率为55%-80%，无进展生存期（progression-free survival, PFS）为9个月-14个月[2,3]。一代TKIs最常见的耐药机制是EGFRT790M突变，三代TKI药物奥希替尼对此类突变具有良好疗效[4]。随着耐药后再活检的广泛应用，人们对于耐药机制的理解逐渐深入，EGFR-TKIs耐药机制除了EGFR突变（一代药物的T790M突变，三代药物的C797S突变），肝细胞生长因子受体MET扩增，组织学转化等外[5,6]，近来发现基因融合的出现也是一种少见但确切的耐药机制。本文将EGFR-TKIs耐药后各种基因融合现象综述如下。

1 耐药融合的发现和发生率

2015年，Klempner等[7]报道2例具有EGFRdel19突变的肺癌患者，分别使用厄洛替尼9个月和10个月后耐药，对于耐药前后的组织标本进行全面基因组测序（comprehensive genomic profiling, CGP），发现耐药后标本同时存在EGFRdel19突变和卷曲螺旋结构域蛋白6（coiled coil domain containing 6, CCDC6）-转染重排（rearranged during transfection,RET）原癌基因融合，而没有EGFRT790M突变、MET扩增等其他耐药机制。使用EGFR-TKI之前的标本没有RET融合。这是最早关于基因融合可能介导EGFR-TKI耐药的报道。

Piotrowska等[8]使用锚定多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）方法回顾性分析起初具有EGFR突变、使用厄洛替尼，吉非替尼或阿法替尼耐药患者的肿瘤组织，发现1例阿法替尼耐药患者具有CCDC6-RET融合，1例化疗/奥希替尼进展后鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF）融合，还有1例阿法替尼/西妥昔单抗进展后二代测序（next generation sequencing, NGS）检测到核受体共激活因子4（nuclear receptor coactivator 4,NCOA4）-RET融合。

对32例使用三代EGFR-TKI奥希替尼耐药后患者的35份组织标本、26份循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）进行检测，1例患者血浆中发现CCDC6-RET和原肌球蛋白3（tropomyosin 3, TPM3）-神经营养性酪氨酸受体激酶1（neurotrophic receptor tyrosine kinase 1 gene,NTRK1）融合。锚定多重PCR方法对24例具有足够组织标本的患者进行检测，发现1例CCDC6-RET融合，1例PCBP2-BRAF融合，1例甘油酯激酶（acylglycerol kinase,AGK）-BRAF融合。值得注意的是，这3例同时都伴有T790M突变的丢失，这可能表明了新出现的融合代表了旁路机制的活化[8]。

分析3,505例具有EGFR突变或接受过EGFRTKIs治疗的NSCLC患者肿瘤或血液标本，发现31例（0.88%）同时具有融合：包括10例（32%）BRAF，7例（23%）间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK），6例（19%）RET，6例（19%）成纤维细胞生长因子受体3（fibroblast growth factor receptor 1,FGFR3），1例（3.2%）EGFR，1例（3.2%）NTRK1。其中12例患者具有治疗前后配对标本，在TKI治疗前不存在融合。3例使用奥希替尼耐药者，融合出现的同时伴有T790M丢失，且具有获得性融合的肿瘤，肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）水平较低（中位，3.5突变/Mb）[9]。

3,014例具有EGFR突变的NSCLC患者进行组织或ctDNA基因组测序，发现28例（0.9%）同时具有活化融合（BRAF12例，FGFR35例，RET5例，ALK4例，NTRK11例，EGFR1例），其中25例没有合并其他耐药机制，而21例可追溯病史的患者都使用过EGFRTKI治疗。10例具有治疗前后配对标本发现TKI治疗前不存在融合，因而确定为获得性融合[FGFR3-转化酸性含卷曲螺旋蛋白3（transforming, acidic coiled-coil containing protein 3, TACC3）4例，棘皮动物微管相关蛋白样4（echinoderm microtubule-associated protein-4,EML4）-ALK 2例，CCDC6-RET 2例，AGK-BRAF 1例，TPM3-NTRK1 1例]，其中3例（2例FGFR3和1例BRAF）配对的融合伴有T790M丢失[10]。

综上，EGFR-TKI耐药后可出现RET、BRAF、ALK等多种基因融合。基因融合在EGFR-TKI获得性耐药机制中发生率不足1%，属于介导获得性耐药的少见事件。现将各种基因融合分述如下。

2 RET融合

2.1 原发性RET融合RET基因是一种位于10号染色体长臂上的原癌基因（10q11.2），其编码的RET蛋白是一种酪氨酸激酶受体，结合配体后刺激胞内区域发生磷酸化，激活下游信号，进一步参与调节细胞的生长和分化[11]。RET基因自身断裂后与其他基因接合发生重组，成为一个新的融合基因，使RET酪氨酸激酶的活化脱离配体的调控，发生自我磷酸化，从而促使原癌基因的转化，引发肿瘤生成[12]。2011年，1例肺腺癌中发现驱动蛋白家族成员5B（kinesin family member 5B,KIF5B）-RET融合，由KIF5B基因的第16号外显子末端与RET的12外显子起始端融合而成，被认为是部分肺癌的驱动基因[13]。

RET融合在肺癌患者中阳性率为1%-2%[12]，并常与EGFR、KRAS、ALK、BRAF等其他基因改变相排斥[13,14]。Takeuchi等[15]对1,114例肺腺癌患者进行检测，共发现14例（1.2%）患者具有RET融合，这些患者女性多见，不吸烟或轻吸烟，且EGFR和KRAS阴性。与RET基因发生融合突变的基因包括KIF5B[13]、CCDC6[16]、三基序蛋白33（tripartite motif containing 33, TRIM33）[17]、NCOA4[18]，其中在NSCLC中KIF5BRET型最常见[18]。

2.2 EGFR-TKI获得性耐药后RET融合 对EGFR-TKIs发生获得性耐药后，RET融合的发生率为0.2%-4.2%[8-10]。但是基因融合出现的确切机制还不清楚。由于未见治疗前EGFR突变和RET融合共存的报道，因此有可能在长期EGFR抑制的诱导下肺癌细胞出现了旁路机制的活化，但是也不能完全除外治疗前即存在RET融合的小克隆，在EGFR抑制后此部分克隆逐渐变成优势的可能。

Rich等[19]分析176例使用EGFR-TKIs后出现RET改变患者中，发现del19比L858R突变患者的RET融合发生率高（0.8%vs0.2%,P=0.04），在伴有T790M和/或C797S的患者中比没有这两个突变的患者发生率更高（1.1%vs4.6%vs0.6%）。RET融合在奥希替尼耐药后发生率（9/184, 4.9%）高于一二代TKI（13/1627, 0.8%,P=0.000,1）。Offin等[20]同样发现三代TKI后出现RET融合的频率更高。174例厄洛替尼或阿法替尼后未检测到融合，而14例奥希替尼后检出3例。但还不清楚是奥希替尼富集获得性融合的潜力更强，还是多线EGFR抑制后反复筛选的结果。

Piotrowska等[8]检测41例奥希替尼耐药患者，发现2例获得性CCDC6-RET融合。在PC9和MGH134细胞（含有EGFRL858R/T790M突变）中表达CCDC6-RET后，细胞对阿法替尼和奥希替尼等EGFR-TKIs耐药，选择性RET抑制剂BLU-667和卡博替尼则可使之敏感性恢复。2例EGFR突变阳性患者使用阿法替尼和奥希替尼后耐药，分别获得CCDC6-RET和NCOA4-RET融合，接受奥希替尼+BLU-667治疗，耐受性良好且迅速反应。研究在细胞和临床层面证实RET融合介导EGFR抑制剂耐药，且这个旁路可被选择性RET抑制剂有效抑制。另有研究[20]在PC9细胞中表达CCDC6-RET和KIF5B-RET融合，RET融合可以导致具有EGFR突变细胞系奥希替尼耐药，奥希替尼降低母代细胞的EGFR和ERK1/2，而不降低子代细胞的ERK1/2磷酸化。联合卡博替尼后对奥希替尼反应恢复。RET融合不改变奥希替尼抑制EGFR磷酸化，证实确实是旁路机制导致耐药。

3,505例EGFR突变患者组织活检，发现6例RET融合，包括1例阿法替尼耐药后出现L858R和NCOA4-RET融合患者，使用卡博替尼+阿法替尼稳定7个月，与前文所述细胞实验结果一致[9]。综上，对于EGFR-TKI耐药后出现RET融合的患者，继续EGFR-TKI联合RET抑制剂可能是一种合理的治疗选择。

3 BRAF融合

3.1 原发性BRAF融合BRAF基因是1988年由Ikawa等[21]首先在人类尤文氏肉瘤中发现的，该基因位于染色体7q34，编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在恶性肿瘤形成、发展过程中发挥重要作用。BRAF蛋白在丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases, ERK）信号通路中起着关键作用，进而调节细胞内的生物学过程[22]。2005年，首先在甲状腺癌中报道A型激酶锚定蛋白9（A-kinase anchoring protein9,AKAP9）-BRAF融合为一种激活MAPK信号通路的新机制[23]。而NSCLC中BRAF融合的发生率为4.3%[24]。2017年美国临床肿瘤学会上，有报道通过NGS在17,128例NSCLC患者中发现42例（0.25%）BRAF融合现象，其中32例（76.19%）为腺癌，融合伴侣以AGK最为常见，占7.14%，其他还包括TRIM24、细胞质分裂付出蛋白4（dedicator of cytokinesis 4, DOCK4）和犰狳重复含蛋白10（armadillo repeat containing 10, ARMC10）等[25]。

未经治疗的肺癌患者同时存在BRAF融合和EGFR突变的报道不多，仅在AURA研究中报道1例使用奥希替尼前NGS发现BRAF融合[26]。

3.2 EGFR-TKI获得性耐药后BRAF融合 Yu等[27]检测136例经过TKI治疗的具有EGFR突变患者，发现2例BRAF融合。对比治疗前后标本，BRAF改变分别为1%和5.1%。但研究也只能证实TKI富集了BRAF改变，不能证实融合为获得性。

Vojnic等[28]检测374例转移性EGFR突变肺癌患者，其中174例为TKI治疗后，其中38例有配对TKI前样本。研究共发现4例患者（2例厄洛替尼后，2例厄洛替尼序贯奥希替尼后）具有BRAF融合［3例AGK-BRAF，1例泛素蛋白连接酶Praja-1（praja ring finger ubiquitin ligase 2 gene, PJA2）-BRAF］。4例患者中2例有TKI前标本，都是BRAF融合阴性。而在200例TKI前的标本中没有检出同时性BRAF融合。

基因编辑将BRAF融合基因导入EGFR突变细胞系（H1975, HCC827, PC9）以及19del+PJA2-BRAF的原代细胞MSK-LX138cl后，细胞对奥希替尼耐药，BRAF、丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase, MEK）1/2、ERK1/2和信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）的磷酸化增加，奥希替尼可以阻断母代细胞而不阻断子代细胞MEK1/2、ERK1/2和STAT3的磷酸化，BRAF敲除后奥希替尼敏感性恢复。MEK抑制剂曲美替尼和奥希替尼可以协同抑制细胞生长，泛RAF抑制剂单药也可抑制具有突变EGFR和BRAF融合细胞系的生长，因而从细胞水平证实了BRAF融合是EGFR-TKI获得性耐药的机制，联合EGFR和MEK抑制或BRAF抑制可能可以克服耐药[28]。因此，对于此类患者，联合抑制MEK和EGFR以及抑制BRAF融合可能是合适的治疗方案。

4 ALK融合

4.1 原发性ALK融合ALK基因位于2p23.2，编码属于胰岛素受体超家族的I型跨膜酪氨酸激酶蛋白。2007年，1例27岁肺癌患者中发现ALK-EML4基因重排，患者2号染色体短臂中存在倒位，使EML4基因和ALK基因的外显子连接，从而形成融合基因ALK-EML4[29]。重排后融合基因编码的嵌合蛋白含有ALK的酪氨酸激酶结构域，结构域的异常表达使得ALK下游信号通路异常活化而具有致癌性。ALK基因重排在NSCLC的总体发生率约为4%[30]。肺癌患者中还存在其他融合伴侣，但以EML4-ALK最为常见[31]。具有ALK融合的肺癌患者，使用克唑替尼、阿来替尼等ALK-TKI治疗有效[32]。

Yang等[33]对977例中国NSCLC患者进行基因检测，发现13例（1.3%）同时存在EGFR突变和ALK融合。Lee等[34]对444例韩国肺腺癌患者进行检测，4例（0.9%）患者同时存在EGFR突变和ALK融合。Dana-Farber癌症研究院检测了50例NSCLC患者，发现3例（6%）同时具有EGFR突变和ALK融合[35]。因此，存在原发性EGFR突变与ALK融合并存的现象，但非常少见。发生双重基因改变的患者多使用一代EGFR-TKI或ALK-TKI单药治疗，各个病例报道反应不一，有效率约为60%[36]。

4.2 EGFR-TKI获得性耐药后ALK融合 2016年，Liang[37]报道1例EGFRdel19突变NSCLC患者，检测EML4-ALK阴性。先后使用厄洛替尼HY-15772两种EGFR-TKI治疗8个月后疾病进展。行ctDNA检测，血浆发现EGFR突变和EML4-ALK重排并存，对ALK抑制剂治疗有反应。

对3,505例使用EGFR-TKI治疗的患者进行检测，发现7例（0.20%）ALK融合[9]。新发ALK的融合伴侣包括EML4（n=4）、钙调素结合蛋白（striatin,STRN）（n=1）、TRK融合基因（TRK-fused gene,TFG）（n=1）、和含普列克底物同源物域家族A成员7（pleckstrin homology domain containing A7, PLEKHA7）（n=1）。出现STRN-ALK融合的患者同时伴有T790M丢失，对单药克唑替尼无反应。而奥希替尼耐药后出现新的PLEKHA7-ALK融合患者对奥希替尼联合阿来替尼的治疗有反应。因此，对于EGFR-TKI耐药后出现ALK融合的患者，继续EGFR-TKI联合ALK-TKI可能是一种较好的治疗选择。

5 FGFR3融合

FGFR3-TACC3融合是膀胱癌等多种肿瘤的常见驱动基因[38]，肺腺癌、肺鳞癌和未分类NSCLC中也都报道过。576例肺腺癌患者行NGS检测，发现FGFR3-TACC3融合的总发生率为0.5%。FGFR3-TACC3融合导致Ba/F3细胞白介素-3非依赖性生长，细胞对泛FGFR和选择性FGFR抑制剂敏感，但是对EGFR抑制剂吉非替尼耐药[39]。

FGFR3-TACC3可能介导EGFR-TKI的耐药。一项研究比较136例EGFR-TKI治疗患者耐药前后的标本，发现FGFR3改变在治疗后更为常见（0.5%vs3.7%,P=0.042）[27]。对17,319例肺癌组织（141,701例腺癌，3,149例非特指型）行CGP分析，发现5例EGFR-TKI耐药后存在FGFR3-TACC3融合并伴有原活化EGFR突变，包括1例使用厄洛替尼后，1例使用阿法替尼后，1例使用奥希替尼后和1例使用三代药物ASP8273后[40]。

细胞和动物实验证实，FGFR3-TACC3融合可以在头颈部鳞癌移植物模型中活化ERK信号通路，逃避EGFR/红白血病病毒癌基因同源物3（erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog 2, ERBB3）阻滞。联合使用阻滞EGFR和ERBB3的抗体时，EGFR阻滞优先抑制ERK活化，而ERBB3阻滞抑制蛋白激酶B（protein kinase B, PKB/AKT）活化。此外，肺癌细胞系NCI-H1975中（EGFRL858R+T790M突变），引入FGFR3-TACC3可导致奥希替尼耐药，而不导致磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3'-kinase,PI3K）突变细胞系的PI3K抑制剂耐药[41]。但是现在还没有获批的抑制FGFR3融合的药物，因此出现FGFR3-TACC3融合后的最佳治疗仍在探索中。

6 NTRK1融合

之前研究报道结直肠癌和甲状腺癌中出现NTRK1和肌凝蛋白磷酸酶Rho相互作用蛋白（myosin phosphatase Rho-interacting protein, MPRIP）、CD74、TPM3或TFG的融合[42]。融合导致结构性TRKA激酶活性增加，可作为癌基因介导肿瘤产生。在3种常用于评估致癌性的非癌症细胞系293T细胞、NIH3T3纤维母细胞和Ba/F3细胞中表达MPRIP-NTRK1和CD74-NTRK1的cDNA，发现表达嵌合蛋白和TRKA自身磷酸化，肿瘤发生锚定非依赖性生长，并导致裸鼠成瘤。而在非肿瘤细胞或对照样本中不存在此种融合。3/91例（3.3%）没有已知癌基因改变的肺癌患者使用NGS或荧光原位杂交检测存在NTRK1基因融合[43]。一些靶向药物，如拉罗替尼、恩曲替尼和Loxo-195等已经获得FDA批准或试验证实对NTRK1融合有效。

3,505例具有EGFR突变的NSCLC患者，发现1例（0.03%）同时具有NTRK1融合，但不确定融合是使用TKI之前还是耐药后出现[9]。EGFR-TKI耐药后也可出现NTRK融合。32例TKI耐药患者，1例血检发现同时具有CCDC6-RET和TPM3-NTRK1融合[8]。由于报道例数较少，NTRK1介导EGFR的具体机制还未证实，TKI耐药后发生NTRK1融合的最佳治疗也未可知。

7 结论

之前未发现融合是介导EGFR-TKI耐药的机制，可能是由于当时使用的基因检测平台未包括融合的检测，而易位断裂点经常发生在内含子区域，聚焦的NGS只检测外显子，因而可能错过这些异常。因此，推荐EGFR-TKI耐药后再活检和使用能够发现激酶融合的基因组测序平台。

一代TKI和三代TKI获得性耐药后基因融合的检出率似有不同，三代药物耐药后融合的发生率高于一代药物（二者分别是3.1%-12.5%和不足1%）[8,9,19,20]，但是不能确定是由于三代药物对于基因融合的诱导能力更强，还是EGFR-TKIs序贯使用反复筛选的结果。大部分时候，T790M突变丢失和替代途径耐药机制相关，因此三代TKI耐药后出现T790M丢失的患者应格外注意融合的检测。另外发生获得性融合后TMB水平较低，因此免疫治疗不一定具有良好效果，而无论对于一代还是三代药物来说，联合使用EGFR-TKI和融合抑制剂可能是合理的治疗选择，但是应注意联合用药的毒性。

总之，获得性激酶融合是EGFR-TKIs罕见但是肯定的获得性耐药机制。在EGFR抑制过程中，需要在进展时使用能够检测包括融合在内的各种基因变化，以明确耐药机制，提供治疗决策。