近日节律基因Per1对恶性肿瘤的侵袭、转移及凋亡影响的研究进展

2020-01-10池昌兴李文辉侯宇李岚夏耀雄王丽常莉

肿瘤防治研究 2020年7期

池昌兴，李文辉，侯宇，李岚，夏耀雄，王丽，常莉

0 引言

在自然界中，大部分生物受光照、温度、空间等影响，在漫长的时间当中不断进化，并逐渐适应周围的环境变化。而在这过程中，大部分生物按照一定的周期性规律、有序地进行生命活动，这种节律性的生命活动现象被称为生物节律。根据周期的长短可将生物节律分为近日节律、亚日节律和超日节律。其中近日节律是指周期为24 h的生物节律，能够调节大部分动植物日常的生物节律周期变化。人体下丘脑视交叉上核（suprachiasmatic nucleus,SCN）是控制近日节律基因表达的主要振荡器，同时也是哺乳动物主要的近日节律的起搏器，驱动着哺乳动物行为和活动的节律表达[1]。近日节律基因在转录和翻译水平上通过正、负反馈回路相互作用并形成近日节律基因网络，调节人体正常细胞的生理活动[2]。在恶性肿瘤的研究中，近日节律基因也起到相当重要的作用。

1 近日节律基因概述

在近日节律基因中，Period1（Per1）、Per2和Per3是目前Pers家族中的三个已知基因。其中Per1）基因在近日节律基因系统中处于核心地位。体内和体外研究表明，Per1不仅参与正常的生理节律调节，也可以作为肿瘤抑癌基因参与细胞增殖、凋亡、周期控制和DNA损伤反应等[3-5]。在恶性肿瘤研究中发现，Per1基因高表达能够抑制恶性肿瘤的侵袭和迁移，促进肿瘤细胞的凋亡并且与患者的预后有密切关系[6]。因此Per1基因在恶性肿瘤发生发展过程中有着十分重要的作用。

2 Per1基因对恶性肿瘤侵袭、迁移和凋亡的影响

日常生活中，近日节律基因参与调节人体各种正常的生理功能，并且在过去的研究中发现近日节律紊乱是促使癌症发展的一个重要的内源性因素。很多实验研究已经证实了近日节律基因中的Per1基因参与非小细胞肺癌、乳腺癌、胶质瘤、宫颈癌等恶性肿瘤的发生发展[7-8]。

2.1 Per1对非小细胞肺癌的影响

既往研究发现，近日节律基因的异常表达与非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的发生、发展密切相关。正常肺组织中per1基因水平的表达较高，但在大量非小细胞肺癌患者的组织样本和细胞系中，Per1基因的表达水平较低[6]；在正常组织中，Per1基因主要由肺泡上皮细胞和正常支气管上皮细胞表达，Per1基因表达的阳性细胞超过了85%。与相邻正常支气管上皮细胞相比，癌细胞中Per1基因的表达降低，而且该表达的异常或缺失可能与非小细胞肺癌的分化不良、淋巴结转移及TNM分期有关。与Per1基因高表达患者相比，Per1基因低表达患者总生存时间较短，5年累计生存率较低。而通过增加癌细胞中Per1基因的表达，可以抑制肿瘤的生长，促进癌细胞的凋亡[9]。提示我们Per1基因的过表达可能对非小细胞肺癌的侵袭、转移具有抑制作用。还有研究同样证实，与正常肺组织相比，在大样本的NSCLC患者的癌组织和NSCLC细胞系中的Per1基因表达水平较低[10]。并且在表观遗传调控的研究中发现，组蛋白H3乙酰化对近日节律基因功能的影响起到也十分重要的作用。此外，非小细胞肺癌细胞系中Per1基因的异位表达可抑制非小细胞肺癌的生长、促进G2～M细胞周期的阻滞、加快癌细胞的凋亡，并降低克隆形成率。

2.2 Per1对乳腺癌的影响

有研究对107例乳腺癌患者的肿瘤和非肿瘤组织中的Per1基因启动子的甲基化谱进行了分析，发现与癌旁非肿瘤组织相比，人乳腺癌组织中Per1基因的甲基化指数更高，尤其是在三阴乳腺癌的患者中，Per1基因的表达显著降低，启动子的甲基化水平显著增高[11]。同时有研究也表明，人乳腺癌组织中Pers基因家族的表达水平较低[12-13]。而抑癌基因的高甲基化和癌基因的低甲基化都可以影响基因的转录。启动子的高甲基化可以抑制基因表达，其中最重要的是可以导致抑癌基因的沉默功能。而癌基因的过表达在恶性肿瘤的发生发展中起到十分的重要作用，可以进一步刺激并导致异常细胞过度增殖。有研究发现癌组织中56.3%的CpG岛在Per1启动子区有甲基化的改变，非癌组织中有29.1%的CpG岛甲基化改变[14]。并且Per1基因启动子区甲基化改变的同时，乳腺癌组织中Per1基因表达也随之改变。相较于正常人而言，近日节律基因机制受到破坏的乳腺癌患者以及夜间工作者的Per1甲基化水平会显著增高[11]。从以上乳腺癌患者Per1基因的表达情况看，Per1启动子区域的甲基化可能是导致乳腺癌发生发展的重要原因之一，并且恶性程度越高的乳腺癌，Per1基因的表达水平越低，启动子甲基化水平越高，这提示Per1基因的表达情况与乳腺癌的预后有一定的相关性，也可能是导致乳腺癌恶化的原因之一。

2.3 Per1对头颈部肿瘤的影响

在对头颈部肿瘤的研究中，通过比较41例口腔鳞癌患者的癌组织与正常的邻近黏膜组织中Per1基因的表达情况，以及这些患者的Per1基因表达与临床病理特征的相关性。结果显示，与相邻的非肿瘤组织相比，肿瘤组织中Per1基因的表达水平较低，并且Per1基因的表达水平随肿瘤进展而降低[15]。同样在食管鳞状细胞癌中，Per1的表达水平显著降低，并且其表达情况与食管鳞状细胞癌的增殖、分化以及TNM分期有关。此外，Per1基因的表达水平与食管鳞状细胞癌的淋巴结转移，远处转移和临床分期呈负相关[16]。因此，Per1基因的表达表现出对食管鳞状细胞癌进展和迁移的抑制作用。在食管鳞状细胞癌患者的癌组织中，Per1活性与VEGF表达之间存在显著的负相关，并且Per1基因表达水平的降低可能影响VEGF的表达。而VEGF的表达与肿瘤的侵袭、转移，发生、发展有着密切关系。

同样另外一项研究表明，与相邻的非肿瘤组织相比，颊鳞状细胞癌患者肿瘤组织中Per1基因的表达显著降低。并且Per1基因表达水平的降低与晚期临床分期相关，其表达水平降低会进一步增加区域淋巴结转移的风险[17]。

基质金属蛋白酶-2（matrixmetalloproteinase-2,MMP-2）在肿瘤细胞的侵袭和转移中起到重要的作用，与Per1基因呈负相关。随着Per1基因表达水平的降低，MMP-2基因表达水平增加[18]。这证实了Per1基因具有抗癌的作用，其表达水平的改变可能与颊鳞状细胞的侵袭和迁移有关。

在另一项关于胶质瘤的研究中发现，下调Per1基因的表达可以降低U343胶质瘤细胞对X线的照射敏感度，减少胶质瘤细胞凋亡[19]。通过Per1基因表达的改变，可以激活CHK2-P53通路以及由X线引起的细胞周期阻滞和凋亡相关的其他基因，如c-myc、p53、p21、cdc2、cyclinB1等，进而诱导胶质瘤细胞凋亡。体现了Per1基因在抑制肿瘤生长和促进肿瘤细胞凋亡中的重要作用。

2.4 Per1对宫颈癌的影响

在对宫颈鳞癌发生、发展的潜在分子机制的研究中发现，通过下调Per1基因的表达可以增加宫颈鳞癌细胞的侵袭能力[20]。并且该研究证实Per1基因和PRKAB1均受hsa-mir-486-3p通路的调控，还发现了MMP-2与宫颈鳞癌的临床分期有关。在既往已有的研究中发现，hsa-mir-486-3p通路通过靶向作用于宫颈癌细胞外基质蛋白1来抑制细胞增殖和转移[21]，MMP-2在宫颈癌中是一种与颈淋巴结和病理分期状态相关的差异表达基因[22]。并且在非小细胞癌中，MMP-2是差异最大的甲基化基因之一，在非小细胞肺癌中也发现Per1基因的表达与MMP-2呈负相关。通过上述研究推测hsa-mir-486-3p调控下的Per1和PRKAB1可能在宫颈鳞癌发生发展的过程中发挥重要作用，并且在hsa-mir-486-3p通路的调控下，随着Per1基因的表达增加，可能会抑制MMP-2的表达，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。

3 Per1基因对恶性肿瘤细胞侵袭、转移和凋亡的调控机制

Per1基因对恶性肿瘤细胞生物学行为的调控机制与DNA的修复、细胞周期的调节、miRNA的调控和参与肿瘤细胞的转移密切相关。

3.1 Per1基因对DNA损伤修复的作用

近日节律基因参与正常细胞的恶变与DNA的修复密切相关。尽管DNA的修复机制有多种，但近日节律基因是目前唯一一种在DNA修复机制中参与调节核苷酸切除修复机制的基因。同时Per1基因在人癌细胞的增殖分化和DNA损伤的调控方面发挥着重要的作用。并且，Per1基因参与近日节律基因的负反馈调节通路，发挥负调控作用[23]。它不但控制节律周期，维持机体正常生理功能，还在肿瘤的发生发展中发挥着重要的调控作用。且c-Myc已被证明通过抑制p53诱导的p21Waf1/Cip1的表达来促进细胞凋亡[24]。Gery等[4]研究中证明了，虽然Ionizing Irradiation（IR）处理导致对照组细胞中c-Myc的适度下调，但在Per1过表达（HCT/Per1）的细胞中，c-Myc表达水平因IR显著上调同时经过IR诱导后的对照组细胞p21Waf1/Cip1表达增加，而在Per1过表达（HCT/Per1）细胞中这种反应明显减弱，过表达Per1基因对DNA损伤诱导的细胞有凋亡致敏作用；相反，在同样处理过的细胞中，抑制Per1基因的表达可以抑制细胞凋亡。这些结果表明，Per1是一个肿瘤抑制基因，其下调可能在肿瘤发生中发挥作用。所以，Per1基因可以通过上调c-Myc和抑制p21Waf1/Cip1使细胞对DNA损伤诱导的凋亡敏感，从而增加对DNA损伤的凋亡，维持正常细胞的生理生化功能。

既往研究认为，启动子序列的CpG甲基化，特别是在抑癌基因或相关基因中，可以使启动子功能失活并导致这些基因沉默。甲基化通常被认为是抑癌基因沉默的关键原因[25]。而小细胞肺癌中，Per1表达的抑制可能是由于Per1基因启动子的甲基化引起的[26]。在乳腺癌的研究中，Per1的异常表达也证明了是由Per1启动子的甲基化而非基因突变造成的[11]。

3.2 Per1基因对细胞周期的调节

在近日节律基因中，有2%～10%的部分近日节律基因通过调节Wee1表达来影响细胞周期（Wee1是一种调节Cdc2活性并因此调节细胞周期的G2期至M期的激酶），而这部分基因可以通过调控细胞的周期，进而促进细胞的凋亡。Per1是控制细胞增殖和代谢正常生理节律的重要近日节律基因之一。Per1基因表达的改变可导致正常细胞的增殖节律被破坏，进而导致肿瘤的发生。并且Per1可以调节许多重要的下游蛋白，通过调节肿瘤细胞周期和增殖能力来抑制肿瘤的侵袭、转移，因此与肿瘤的发生和发展密切相关[27]。c-Myc是细胞周期相关基因，同时也是一个癌基因，并且能够调节细胞周期从G1到S期转换，在肿瘤细胞的增殖过程中起到重要作用[28]。c-Myc基因启动子上含有E-box结构域，Bmal1/Npas2异二聚体能与E-box结构域结合，并抑制c-Myc基因的转录。而Bmal1蛋白的异质二聚体可与Per1启动子区域的E-box结合元件结合。根据Repouskou等[29]的研究发现，c-Myc的转录通常作用于与MAX的二聚体并与E-box元件结合，当过表达时，c-Myc能够通过选择性作用E-box序列进而抑制BMAL1/CLOCK的Per1反活化。因此推断通过调控Per1基因的表达，Per1可能通过启动区域的E-box元件与Bmal1异二聚体结合，增加Bmal1的表达，从而抑制c-Myc基因的启动，进而维持细胞周期的稳定。

3.3 Per1基因与miRNA之间的作用

Per1基因可能通过miRNA的调控，进而影响肿瘤侵袭和迁移。在许多研究中，miRNA已被证明参与许多细胞的生理过程，包括通过与3个未翻译区域（UTR）结合来控制生物钟的节律基因[30]。在一项关于miR-29a/b/c通过靶向Per1的3'UTR进而调控Per1表达的研究中发现，过表达miR-29a/b/c可降低Per1基因的mRNA和蛋白表达。而根据研究的数据分析，Per1基因的表达降低会造成近日节律周期的紊乱[31]。miR-29a在体外对肺癌细胞具有显著的抗侵袭和抗增殖作用。这种抗肿瘤的生物学特性很可能是通过转录后调节细胞中蛋白的水平所产生的[32]。因此通过上游的miR-29a/b/c对Per1的调控，可能影响肿瘤内Per1基因的表达，从而影响肿瘤细胞的近日节律周期，进而使肿瘤的侵袭、迁移能力降低。

3.4 Per1基因参与肿瘤细胞的迁移

在最新的研究中发现近日节律基因Per1可以调控Ki-67、mdm2、c-Myc、p53、bax、bcl-2、MMP-2、MMP-9等下游重要的肿瘤相关基因[33]。在口腔鳞癌的研究中发现，Per1基因敲除还能增加细胞Ki-67、mdm2、bcl-2、MMP2和MMP-9 mRNA的表达，降低c-Myc、p53、bax和TIMP-2的表达[34]。Chang等[35]证明了Per1通过调节MMP-2的表达和层黏连蛋白受体1的细胞内分布来调控癌细胞的增殖、侵袭和迁移。而Per1蛋白表达的降低，上调了MMP-2的表达，增加了层黏连蛋白受体1在细胞膜上的分布，从而增强了肿瘤的侵袭和迁移。