促红细胞生成素肝细胞激酶受体及其膜结合配体相关因子在口腔疾病中的表达及作用机制的研究进展

王琦 刘琰 赵云 孙立众 王琳璇 韩梅 米方林

1.川北医学院口腔医学系，南充 637000；2.川北医学院附属医院修复科，南充 637000

促红细胞生成素肝细胞激酶受体（erythropoietinproducing hepatomocellular receptor，Eph）及其膜结合配体（Eph receptor-interacting proteins，ephrin）可通过细胞与细胞间短距离的信号传导，参与调节生长发育和疾病发生发展的各个过程，包括神经发育及再生、干细胞分化、肿瘤发展、细胞迁移、免疫功能以及骨组织重建等。近年来有关Eph/ephrin的研究已经逐渐深入，但Eph/ephrin与口腔疾病的发生、发展关系尚不十分明确。鉴于Eph/ephrin在机体生理及病理变化中的重要作用，研究Eph/ephrin与口腔各疾病的相互作用及致病机制，可为口腔常见病、多发病的防治提供新的思路。

本文对Eph/ephrin相关因子在口腔疾病中的表达及作用进行综述，从而了解其在牙周炎骨再生、正畸骨改建及口腔肿瘤转移机制的研究进展。

1 Eph家族

酪氨酸蛋白激酶受体是一个庞大的家族，其最大的亚家族是Eph受体，ephrin是其配体。Eph受体胞内区由4个部分组成[1]，即SAM（sterile-α-motif）结构域、酪氨酸酶活性结构域、保守的近膜结构域和PDZ（postsynaptic density protein-disc large-zona occludens）结构域，上述结构均与信号传导密切相关。Eph受体胞外区同样由3个部分组成，即纤维连接蛋白Ⅲ型重复序列、半胱氨酸富集区和配体结合域。Eph受体可依据序列的同源性和对应配体的亲和力分为2个亚类，即EphA和EphB亚家族；其中EphA包括EphA1—EphA8，EphB包括EphB1—EphB6。ephrin也分为2个亚类，其中ephrinA包括ephrinA1—ephrinA5，ephrinB包括ephrinB1—ephrinB3。

研究[2-3]表明，Eph需与对应的配体ephrin在胞外结合，同时激活Eph受体从而发挥调控作用，事实上并非同一组的受体和配体以同等亲和力相互结合，有时也存在特例，如EphA4可同时与ephrinA和ephrinB结合，EphB2也可与ephrinA5结合。Eph和ephrin作为膜结构蛋白，依赖细胞近距离接触而活化，通过膜结合或抗体成簇2种方式相互激活而发挥作用。当Eph受体与ephrin配体近距离接触时，会发生方向相反的双向信号传导作用，以ephrin为配体向Eph表达细胞胞内传导信号（即依赖Eph激酶活性正向信号）的同时，也可作用于自身细胞发挥反馈调控作用（即依赖Src家族激酶及其效应分子的反向信号）。尽管在具体的作用机制中表现略有差异，但Eph家族仍具有高度保守性，具有维持特异性功能稳定的作用。

2 Eph/ephrin参与多种生物学过程的作用和机制

Eph/ephrin在调节神经发育及再生、干细胞分化、肿瘤发展、细胞迁移、免疫功能以及骨组织重建等方面都发挥着重要作用[3]，尤其在调控神经发育及再生、促进血管生成、参与骨改建等方面作用显著。

初始神经元因具有多向分化潜能，能通过有丝分裂最终分化成多种类型的终末神经元，其中Eph/ephrin参与神经管形成、自我更新、分化、增殖、迁移和黏附等全过程[4-5]。研究[6-7]表明，ephrinB在早期神经管形成中，通过与Reelin受体形成复合物而发挥作用，敲除ephrinB会导致神经管形成障碍，有趣的是，EphB也能与Reelin受体相互作用，提示在神经元形成早期，可能存在ephrinB2-EphB4-Reelin复合体，且对神经管发育有重要作用。随后在神经元的短距离迁移过程中，ephrinA-EphA提供前移信号，ephrinB提供后移信号，敲除ephrinB/ephrineA均能使神经元丧失迁移的能力[8]。此外，ephrinB1/B2还被证实与轴突间互不兼容的特性相关[9]。

血管生成是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，主要包括激活期血管基底膜降解，血管内皮细胞的激活、增殖、迁移，以及重建形成新的血管和血管网。有研究[10-11]表明，血管生成中ephrinB2-EphB4扮演重要角色，其中，ephrinB2最早表达于动脉形成区域，而EphB4早期主要存在于静脉形成区域，小鼠体内敲除ephrinB2-EphB4会导致血管生长和成型畸形，说明二者可能对2种血管的早期边界形成起着重要作用。还有研究[12]通过斑马鱼和小鼠体内实验，发现ephrinB2-EphB4相互作用促进了主动脉背侧上皮细胞最先富集，并形成早期管腔，随后在EphB4作用下诱导上皮细胞从早期主动脉背侧分离、迁移形成早期静脉。随后，在血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的刺激下，ephrinB2通过PDZ结构域与VEGF相互作用，从而促进血管增殖、分化及成管型[13-14]。

骨改建的生物学过程是骨吸收和骨形成的动态平衡过程，需要依赖成骨和破骨细胞的偶联作用，即使外界环境发生改变，生理性的骨改建也会维持在相对平衡的水平[14-16]。近年来，ephrinB2-EphB4和ephrinA2-EphA2信号通路在骨改建中逐渐成为研究热点。Zhao等[17]发现，正向信号中，ephrinB2由破骨细胞发出，激活EphB4诱导成骨分化；反向信号中，EphB4由成骨细胞发出，激活ephrinB2抑制破骨分化。这一发现，成功解释了骨改建中骨吸收向骨形成转化具有有序性和同一性，提示了该信号传导是骨吸收和骨形成偶联的关键机制[1,18]。Tonna等[19]通过敲除小鼠破骨细胞的ephrinB2发现，骨矿化作用延迟2倍，骨刚度明显降低。Irie等[20]通过体外细胞培养发现，ephrinA2-EphA2在成骨细胞和破骨细胞均有表达，且破骨细胞上的ephrinA2和成骨细胞上的EphA2可相互作用。正向信号通过EphA2抑制成骨细胞生成，反向信号则通过ephrinA2促进破骨细胞分化和成熟，即ephrinA2-EphA2通路的相互作用能促进破骨细胞的分化发展[21]。也有研究证实，Eph/ephrin双向信号可以调控成骨细胞的分化。Kwan Tat等[22]通过构造大鼠骨关节炎模型，发现在骨关节炎软骨下的骨组织中，成骨细胞EphB4表达增强，而ephrinA2刺激后破骨细胞数量相应减少，从而缓解骨吸收，此外，ephrinA2也可降低与其共培养破骨前体细胞的骨吸收活性，从侧面证实了ephrinA2对骨关节炎的组织具有保护作用。

3 Eph/ephrin在口腔相关疾病中的作用

Eph/ephrin在口腔相关疾病中发挥重要作用，尤其是在牙周炎、正畸及口腔肿瘤中的作用已逐渐受到研究者的重视和青睐，研究Eph/ephrin在口腔相关疾病的机制具有重要的临床意义。

3.1 牙周炎的治疗

牙龈卟啉单胞菌是公认的慢性牙周炎最主要的致病菌之一。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作为其最重要的致病因子，在牙周炎引起的骨吸收上起着重要作用[23]。张祎[24]针对牙龈卟啉单胞菌LPS引起的牙槽骨骨稳态失衡的状况下Eph/ephrin的参与情况进行研究，通过在体外建立小鼠破骨细胞-成骨细胞共培养系统，经蛋白印迹检测发现，经破骨细胞诱导组的ephrinB2蛋白表达明显，而未诱导组无表达。高浓度的LPS对成骨细胞-破骨细胞共培养体系中的EphB4蛋白表达有促进作用，对ephrinA2未见明显作用，这也验证了牙周炎环境下EphB4的表达参与了骨改建过程。同样，Gao等[25]做类似的试验来研究牙龈卟啉单胞菌LPS与EphA2的关系，分别用LPS与小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞和小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7共培养，结果发现，LPS能够促进MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞EphA2的表达，从而影响破骨细胞表面的EphA2受体向成骨细胞传递的正信号来抑制成骨细胞的分化和反向信号来促进破骨细胞分化。

Li等[23]用牙龈卟啉单胞菌LPS刺激牙周膜成纤维细胞，用聚合酶链式反应技术和免疫印迹法进行检测，与空白组相比，经过LPS刺激之后，在牙周膜成纤维细胞中检测到ephrinA2、EphA2表达量都相应提高，EphB4表达量下降，ephrinB2保持不变。该结果充分说明牙龈卟啉单胞菌LPS可以通过促进ephrinA2、EphA2表达和抑制EphB4表达，引起骨改建失调，从而导致牙槽骨吸收。

雷利红等[26]通过实验性大鼠牙槽骨吸收模型观察ephrinB2-EphB4信号在牙周炎牙槽骨吸收、重建过程中，探讨破骨细胞和成骨细胞相互作用的过程和机制。该研究建立体外破骨细胞吸收模型和牙槽骨吸收动物模型，通过Western blot检测成骨细胞、破骨细胞的ephrinB2-EphB4蛋白表达，并用免疫组织化学法检测牙槽骨吸收模型中ephrinA2表达，结果发现：破骨细胞中均有ephrinB2-EphB4表达，且ephrinB2表达较明显；成骨样细胞中也均有表达，且EphB4表达较明显。这与Martin等[27]发现的成骨细胞可共表达ephrinB2、EphB4的结论相一致。这些结论验证了ephrinB2-EphB4参与牙周炎动物模型的骨改建。

口腔中许多炎症介质会因为牙周炎致病菌的入侵而引起其自身表达，从而激活宿主的一系列免疫炎症反应过程，即促炎细胞的产生。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是牙周炎病理过程中起着关键作用的因子之一，对于破骨细胞分化具有明显的促进作用，但是对成骨细胞分化的作用还存在很大争议[28]。Wang等[29]以不同浓度的TNF-α作为不同强度的炎症刺激，探讨ephrinB2-EphB4正向信号在这个过程中的作用，与对照组比较后发现，低浓度（0.1、1 ng·mL-1）TNF-α处理后ehpB4的mRNA和蛋白表达水平较对照组明显升高，而高浓度（10 ng·mL-1）TNF-α处理后则明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。该结果提示，不同浓度TNF-α可以影响ephrinB2-EphB4正向信号的表达量，导致成骨细胞分化存在差异，低浓度TNF-α可以使ephrinB2-EphB4升高从而促进成骨细胞分化，而高浓度的TNF-α可以抑制成骨细胞分化。此外，该研究还发现，利用携带EphB4小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）的慢病毒干扰细胞内的EphB4表达，从而干扰了ephrinB2-EphB4正向信号，逆转了低浓度TNF-α对细胞成骨分化的促进作用；利用ephrinB2-fc激活ephrinB2-EphB4正向信号后，减弱了高浓度TNF-α对细胞成骨分化的抑制作用。需引起关注的是，外伤导致骨折对骨改建也有很大的影响。骨折愈合过程中，有多种炎症因子参与，随着炎症因子的释放，促进成骨细胞分化和基质分泌，成骨细胞和破骨细胞相互作用进行骨改建[30]。这也可侧面反映牙周炎起初形成时炎症因子浓度低，骨改建没有失衡，牙槽骨没有吸收。待炎症因子增多浓度升高后，破骨细胞分化明显，成骨细胞分化抑制，平衡被打破，牙槽骨吸收。Shen等[31]做了类似的试验，利用RNA干扰技术合成ephrinB2和EphB4基因的siRNA，再下调ephrinB2-EphB4的表达，骨形成受到抑制，与成骨相关标志物的mRNA和蛋白表达也有所下降，与此同时，骨细胞数和破骨标志物表达升高，这些相应的骨改建活动是由EphB4表达降低引起的；但是试验中也发现，降低ephrinB2的表达对上述指标则无明显影响，推测可能是其他因子提供了代偿功能，例如ephrinB1。该研究再次验证了EphB4在炎症骨缺损愈合中起至关重要的作用。

3.2 正畸治疗

与正常牙周组织相比，正畸加力后，牙周组织会出现一系列的组织反应，如牙龈组织增生或萎缩，牙周膜和龈沟液的反应变化，牙槽骨改建等。正畸力引起的牙周组织反应具有炎症反应的特征[32-33]。Ghijselings等[34]发现，正畸治疗过程中龈沟液中的牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和螺旋体的数目增加，这3种微生物都是牙周病致病菌，会引起牙周不同程度的炎症反应，该发现证实，在正畸治疗中牙周处于“炎症”状态，但与真正的牙周炎有所区别。

在正畸牙齿移动过程中，牙周膜成纤维细胞是机械力的第一受体，能通过调节机械刺激和介导骨改建过程来调控牙齿移动。然而，作为依赖机械刺激的骨改建过程，相关分子调节牙周膜成纤维细胞和牙槽骨成骨细胞的机制尚未完全清楚。有学者[35]提出，机械刺激通过调节ephrinA2及其在牙周膜成纤维细胞和成骨细胞上EphA2受体间的相互作用，导致成骨细胞和牙周膜成纤维细胞的分化，作用于牙齿正畸过程中的骨移动。但目前有关机械刺激依赖性调节ephrinA2在牙周膜细胞中的作用尚无充分的证据来解释。还有学者[20,36]认为，在正畸牙移动过程中，EphB4-ephrinB2信号通路参与了压力侧牙周组织改建的调控。Diercke等[37]认为，压力引起ephrinA2在牙周膜成纤维细胞中表达上升，继而导致骨生成减弱。杜沿林等[38]通过动物实验研究正畸过程中ephrinA2的表达与分布，该研究取36只雄性大鼠建立正畸模型，上颌左侧第一磨牙正畸加力设为实验组，上颌右侧第一磨牙不加力设为对照组，通过免疫组织化学法检测ephrinA2的表达，结果发现：对照组牙周膜弱阳性表达ephrinA2，主要分布于成纤维细胞的细胞质和细胞膜；实验组在正畸加力12 h时，ephrinA2在牙周膜中表达增强，要分布于成纤维细胞、前体破骨细胞的细胞膜上，且压力侧表达强度高于张力侧（P＜0.05）；随正畸加力时间延长，实验组ephrinA2阳性表达强度增加，3 d时达到高峰，7 d时开始下降，14 d时接近对照组水平。该研究还发现，正畸加力后，远中侧ephrinA2表达出现相应的下降，推测实验组加力后远中侧为张力侧，破骨细胞活动减弱，骨沉积加强，这也与其他研究[20,35,37]发现的ephrinA2-EphA2可促进破骨细胞抑制和成骨细胞生成的作用相符。

3.3 口腔肿瘤的治疗

Eph/ephrin信号通路参与多种肿瘤的形成、发展、转移等，Eph/ephrin通路相关因子在肿瘤组织中的表达可作为肿瘤预后判断的重要指标。EphrinB2在肿瘤血管中广泛表达，可通过诱导血管内皮生长因子受体被内皮细胞摄取，激活下游信号蛋白Rac1、Akt和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK），通过吞吐作用参与淋巴管生成[39]。Ephrin是肿瘤细胞侵袭、转移和血管生成的重要介质。研究[40]表明，在多种肿瘤中，包括卵巢癌、子宫内膜癌、食管鳞状细胞癌等，ephrinB2提示预后不良。

Shao等[41]的研究表明，EphA2在舌癌中的表达高于正常组织，且参与肿瘤中的血管形成，其表达量与肿瘤恶性程度及预后均具有相关性，因此检测EphA2可能对舌癌恶性程度的判断及预后有重要意义。此外，Shao等[41]研究还发现，ephrinA1和EphA2的mRNA及蛋白的表达在肿瘤组织中均高于正常组织，免疫组织化学的阳性染色率也高于正常组织，且其表达与肿瘤微血管密度、TNM分期、神经浸润性、血管浸润性均有相关，同时发现EphA2属于非酪氨磷酸化状态。口腔鳞状细胞癌在口腔颌面肿瘤中最为常见，约40%的口腔鳞状细胞癌具有淋巴转移或复发倾向。近年来，关于口腔鳞状细胞癌的研究很多，目前认为该疾病预后差、存活率低的原因在于其复杂的转移机制，包括细胞从肿瘤中分离，细胞的运动调节，通过淋巴以及血管的侵袭、增殖等[42]。Eri等[43]研究表明，低氧诱导因子1-α是口腔鳞状细胞癌中ephrin表达的触发因素，此外，ephrinB2与口腔鳞状细胞癌细胞的恶性程度相关，提示ephrinB2可能调节口腔鳞状细胞癌的进展。敲除ephrinB2后，口腔鳞状细胞癌细胞的黏附、迁移及浸润受到抑制，但用EphrinB2-EphB4/Fc嵌合体处理细胞则未发现有明显的影响，说明ephrinB2在肿瘤发展中的作用与EphB4无关。EphrinB2在口腔鳞状细胞癌细胞中的过表达可能是通过抑制周围细胞附着、增殖、迁移并且侵袭周围细胞而促进肿瘤的发展；而EphB4则是通过促进血管生成，促进癌细胞迁徙、增殖，增加癌细胞存活而促进肿瘤的发展[44-45]。也有学者[41]推测，ephrin/Eph在肿瘤中的高表达是由于ephrin/Eph在正常组织和细胞中可以互相结合，发生自身磷酸化和降解，而在肿瘤细胞中无法有效结合，细胞间黏附力下降，使其在肿瘤细胞中堆积而表现为高表达。

ephrin/Eph信号通路作为调控细胞黏附、迁移以及血管生成等过程的重要参与者，不论是在肿瘤预后、良恶性诊断或是作为靶点进行肿瘤治疗方面都有重要意义，通过研究ephrin/Eph信号通路可以为口腔颌面部肿瘤的治疗提出新的方向。

尽管已证实Eph/ephrin参与了细胞增殖、分化等生物学过程，但Eph/ephrin是否与上游基因转录或下游细胞因子级联反应相关，目前并不十分清楚，仍需进行代谢组学和信号组学等方面的研究。此外，Eph/ephrin不同亚家族间的相互作用和机制，仍需重点关注和深入研究。目前Eph/ephrin通路在口腔领域的研究还相对较少，在牙周炎防治、正畸骨改建及口腔肿瘤防治中的研究逐步展开，未来针对Eph/ephrin通路为核心的靶向用药开发，能够帮助减慢骨吸收、减少肿瘤转移和复发，从而为口腔疾病的治疗提供新的方向。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。