利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术联合T细胞斑点试验对泌尿系结核的诊断效果评价

吴素方，梁丽丽，郑淑兰，刘新

作者单位：河南省胸科医院结核科，河南 郑州450003

泌尿系结核（urinary tuberculosis，UTB）是一种较严重的肺外结核类型，其发病率约占结核病的4%，在肺外结核病人中其发病率30%～40%［1］。UTB起病隐匿，临床表现具有多样性，可表现为呈腰部疼痛、午后低热、尿急、尿频、尿痛、乏力、排尿不适等，其临床症状通常在疾病晚期出现，常导致诊断的延误，进而引起泌尿系统器官的损毁［2］，UTB的临床表现特点，突显了早期快速诊断的重要性。目前，结核病诊断的“金标准”是细菌学检查，但是由于UTB病人的尿液标本分枝杆菌培养需时长，且阳性率低，不能满足临床早期快速诊治的需要；传统涂片镜检抗酸涂片假阳性率较高，结果往往不可靠。因此，迫切需要能够快速准确检测结核分枝杆菌复合群的新方法。利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（GeneXpert MTB/RIF，简称Xpert）是一种全新的分子诊断技术，具有较高的诊断灵敏度［3-4］；结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT）具有快速简便、特异性高的特点［5-7］。近年来，使用两种方法用于肺结核诊断的文献报道很多，但少有联合用于肺外结核诊断的比较研究。本文主要探讨Xpert联合T-SPOT对UTB诊断效能的评价，旨在为UTB早期诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年1月至2018年12月河南省胸科医院就诊，临床疑似UTB病人89例。病人入组条件为具有尿急、尿频、尿痛、排尿不适、血尿、腰痛、乏力等临床症状或尿常规检查异常病人。所有接受抗结核药物治疗不足1个月，未进行泌尿系手术治疗。所有病人HIV检测阴性。

病人的人口学信息及临床特征（如性别、年龄、病史、并发症、泌尿系统器官累及的范围及病变形式）等内容均来源于临床原始病史记录，临床资料完整。病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 UTB病人的临床诊断依据和排除标准BACTEC MGIT 960分支杆菌培养阳性；典型的临床表现、实验室尿常规检测、结核菌素试验、结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT）等相关检查有阳性结果、泌尿系影像学表现、膀胱镜活检病理检查有结核、抗结核药物治疗反应良好。临床诊断为非UTB的依据为：病人没有结核分枝杆菌培养、影像学、病理学等其他结核方面证据，并且抗结核药物治疗无效者。

1.3 检测方法

1.3.1 样本采集 收集每例病例24 h尿沉渣标本至少5 mL，每份标本进行涂片查抗酸杆菌、MGlT 960分枝杆菌培养和Xpert检测。同时取病人静脉血5mL，肝素抗凝，进行T-SPOT检测。

1.3.2 尿液标本涂片查抗酸杆菌 一次性吸管吸取少许无菌标本采集管中的尿液标本涂于载玻片上进行荧光染色（珠海贝索生物有限公司），置光学显微镜下（Olympus，日本）观察计数，以每50个视野抗酸杆菌≥3条为阳性。

1.3.3 液体培养 取2 mL尿液标本用于培养，使用MGIT 960分枝杆菌液体培养系统（BD，美国）按照操作说明书进行。液体培养时间设定为42 d。仪器自动报告阳性后，取培养液涂片镜检，若查到抗酸杆菌则为阳性；若未见抗酸杆菌则为阴性。

1.3.4 Xpert检测 取1 mL尿液标本与标配处理液常规按1∶2比例混合，旋紧管盖，涡旋振荡15-30 S，室温静置15 min，使标本充分液化。吸取2 mL液化的标本至Xpert反应试剂盒，置于Xpert检测系统（Cepheid，美国），仪器开始进行自动化检测。约2 h反应结束后，在检测系统窗口下可直接观察测试结果判读检测结果，结果根据探针循环阈值（Ct值）判断［5］。当内对照探针Ct值≤38视为阳性，对照探针Ct值＞38视为阴性；如果读出结果显示“invalid”“error”“no result”时，若样本足够时应重复检测一次。

1.3.5 T-SPOT试验 采集病人空腹静脉血5 mL，肝素抗凝，加入淋巴细胞分离液离心，分离外周血单个核细胞，洗涤与计数后制备成工作浓度细胞悬液，将工作悬液和结核特异抗原加入预包被有干扰素-γ（IFN-γ）抗体反应孔中，37 ℃、5%二氧化碳孵育过夜，洗涤微孔板加入酶标抗体，洗涤微孔板加入底物反应液，记录斑点形成细胞数。结果判读：当阴性对照孔斑点数0-5，ESAT-6或CEP-10抗原孔斑点数-阴性对照孔斑数点数≥6时，则为阳性；当阴性对照孔斑点数≥6时，孔斑点数≥2倍阴性对照斑点数时，则为阴性。

1.3.6 灵敏度和特异度的计算 以临床诊断为标准。灵敏度＝真阳性例数／（真阳性例数+假阴性例数）×100%；特异度＝真阴性例数／（真阴性例数+假阳性例数）×100%。

2 结果

2.1 一般情况和检测结果 共计91例病例符合纳入条件，其中2例为HIV感染者，最终进行数据分析的病例数为89例。其中42例（47.1%）病例临床确诊为UTB，UTB病人中分枝杆菌培养阳性18例（42.8%）；其余24例（57.1%）以典型临床表现、泌尿系相关影像学表现、膀胱镜活检病理结果、及抗结核药物治疗有效等作为诊断依据。47例（52.8%）病例被临床诊断为非泌尿系结核。见表1。

表1 临床疑似UTB病人89例临床检测结果的比较/例（%）

UTB病例的临床资料显示，其病程较长，一般1.5～3年，在各个年龄段均有发病，但以老年男性居多。病人通常合并有尿常规的异常比例升高，临床表现更多地表现为尿频、尿急、夜尿增多等储尿期症状及腰痛明显；同时伴有严重的肾脏破坏，更易并发肾盂积液，输尿管增厚、狭窄或扩张，膀胱挛缩等症状。与非UTB病人相比，病人同时合并有生殖系统结核及慢性肾脏疾病的比例升高。

2.2 Xpert联合T-SPOT诊断UTB的灵敏度和特异度 以临床诊断作为金标准，抗酸杆菌涂片、液体培养、Xpert和TSPOT以及Xpert+TSPOT联合检测的灵敏度和特异度，见表2。

表2 临床疑似UTB病人89例5种检测方法的灵敏度和特异度比较/例（%）

抗酸杆菌涂片的灵敏度为11.8%，显著低于液体培养的灵敏度42.8%（χ2＝21.215，P＜0.001）。T-SPOT的特异性为74.4%，显著低于抗酸杆菌涂片的特异度95.7%（χ2＝11.255，P＜0.01）。T-SPOT的灵敏度为 85.7%，显著高于 Xpert的灵敏度（χ2＝15.321，P＜0.01）。

Xpert+T-SPOT联合检测的特异度为100%，灵敏度为89.4%，显著高于抗酸涂片（χ2＝57.225，P＜0.001）、液体培养法（χ2＝19.112，P＜0.001）、Xpert检 测（χ2＝7.823，P＜0.01）和 T-SPOT 检 测（χ2＝2.573，P＜0.05）。

3 讨论

UTB起病隐匿，泌尿系统的损伤呈渐进性发展，早期临床表现的缺乏和非特异性常导致诊断的延误。这对临床上UTB的诊断提出了挑战。Xpert是世界卫生组织（WHO）推荐的遏制结核病的检测方法［8-9］，于2013年又推荐用于肺外结核的诊断［10］。近年来的多项研究表明，Xpert用于肺结核的诊断均有较高的灵敏度和特异性，但对肺外结核的诊断研究并不多。Bahr等［11］证实了应用Xpert检测脑脊液标本诊断结核性脑膜炎的灵敏度达72.0%（13/18），远高于脑脊液抗酸杆菌涂片灵敏度（27.8%，5/18；P＝0.008），与结核分枝杆菌培养灵敏度相似71.2%（12/17），但培养法造成了27d的诊断延误。王桂荣和黄海荣［12］应用Xpert技术通过检测骨关节结核部位的脓液标本证实了此项技术快速诊断骨关节结核的高灵敏度（82.0%，41/50）和高特异度（100.0%，10/10），并证实了Xpert检测利福平耐药的灵敏度和特异度均为100.0%。本研究中，Xpert检测的灵敏度为64.2%，较低于以上研究结果，考虑可能与尿液结核菌含量较低、Xpert检测方法检测限值有关。

T-SPOT通过结核分枝杆菌特异性抗原多肽刺激T淋巴细胞分泌IFN-γ，与微孔板IFN-γ抗体结合，通过显色反应后形成色素沉淀斑点，达到诊断结核感染的目的［13-14］，是一项检测血清干扰素-γ（IFN-γ）、抗原特异T淋巴细胞极为敏感的技术，且不会受到T淋巴细胞数量、卡介苗和非结核杆菌的影响，即使在免疫功能低下的人群中，T-SPOT的灵敏度仍然较高［15-17］。本研究中血清T-SPOT检测的灵敏度为85.7%（36/42），特异度为74.4（35/47），且在临床诊断为UTB，而在涂片、培养及Xpert均为阴性的病人中T-SPOT的阳性率为81.3%（26/32）弥补了UTB病原学检测灵敏度低的问题。本研究结果显示T-SPOT在非UTB病人中的阳性率达到25.5%，显著高于其他方法，究其原因是由于其对潜伏性结核感染的灵敏度较高，我国是结核高负担国家，人群中潜伏性结核感染率较高，这就是导致T-SPOT检测特异度不高的原因。

在临床诊断UTB病人中，Xpert联合T-SPOT检测的灵敏度为89.4%（38/42），特异度为100%（47/47），其灵敏度及特异度显著大于抗酸涂片，液体培养，Xpert检测以及T-SPOT检测，两者的联合使用既弥补了Xpert的灵敏度不足也能够弥补T-SPOT特异度不足的缺陷，且用时更短。UTB的早期临床表现的隐匿性和不典型性，使其诊断较为困难，因此，尽早对可疑病人进行Xpert联合T-SPOT检测，能及早发现结核病的诊断依据并进行鉴别诊断，从而能够选择合适的抗结核治疗方案治愈UTB病人，避免肾功能损害及后遗症。此两种方法的联合检测对于UTB的临床诊断有着非常好的临床应用价值，值得广泛推广应用。但是由于此两种方法的实验室条件要求较高，在基层医院开展尚存在一定困难，因此简易便携的实验仪器和试剂是重要的研发方向。

在检测方法的比较研究中，病例的选择、样本的采集、检测试剂的厂家以及操作人员等都是可能的影响因素，因此有必要开展更严谨、人群规模更大的研究。